何海燕， 陸秀青， 秦文芳，何雪穎，韋秋艷，覃擁靈*

（1.河池學院，廣西宜州546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室，廣西宜州 546300；3.廣西壯族自治區(qū)糧油質量檢驗站，廣西南寧 530031）

纖維素是自然界儲量最豐富的聚合物，據(jù)估計每年生物圈產生纖維素9×109t，是地球含量最豐富的可再生能源物質 （王超和章超樺，2003）。纖維素在降解前一般都要進行預處理，破壞纖維素的結晶結構和木質素的結構，提高接觸比表面積和酶對纖維素的可及性，從而提高纖維素和半纖維素的轉化率。目前預處理技術主要包括物理法、化學法、生物法，這些方法各有優(yōu)缺點,可同時選用多種方法對纖維素進行預處理（Mohammed 等，2018）。

表面活性劑可以用來提高纖維素的水解率，其中非離子表面活性劑被認為是更合適的可提高纖維素水解率的物質（周妍等，2015）。研究表明，非離子表面活性劑是多種酶的激活劑，對酶活性的保護和增效具有特殊的作用，而Tween（多聚山梨醇酯）系列的表面活性劑作為非離子型表面活性劑的典型代表被廣泛應用于試驗中（王丹等，2002）。

本試驗以前期研究篩選得到的1株高產β-葡萄糖苷酶的米曲霉HML366為出發(fā)菌株，以甘蔗渣為原料，采用固態(tài)發(fā)酵的方法，向不同濃度酸堿處理的甘蔗渣粉末中加入不同濃度的化學表面活性劑Tween 80，研究不同預處理方法及表面活性劑對米曲霉HML366固體發(fā)酵產纖維素酶的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗室保存的HML366米曲霉菌種，粉碎后過80目篩的甘蔗渣（廣西河池市宜州博慶糖業(yè)公司）。

1.2 試劑 0.05 mol/L、pH 4.5的檸檬酸緩沖溶液 （Smettem，1987）；3，5- 二 硝 基 水 楊 酸 溶 液（DNS）（Ghose，1987）；Mandels溶液 （Mandels等，1976）；0.5 mg/mL BSA的配制：先完全溶解牛血清蛋白標準品（5 mg/L BSA），從中取 10 μL 并用0.9%NaCl稀釋標準品至100 μL，充分混勻；濃度為1 mol/L的葡萄糖；0.9%生理鹽水；濃度為0.2%、0.5%、1.0%的 Tween 80； 濃度為 2%、5%、10%的氨水；濃度為2%、5%、10%的乙酸。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNS濾紙酶活力檢測 根據(jù)林英等（2006）、趙春玲等（2006）的方法檢測 DNS 濾紙酶活力。一個酶活力國際單位（U）表示在標準狀態(tài)下1 min轉化1 μmol底物所需要的酶量（管斌和丁友，1999）。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的制作 根據(jù)張樹政（1984）的方法以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以對應的540 nm波長吸光度值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.3 制備培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （PDA）培養(yǎng)基根據(jù)沈萍和陳向東（2007）的方法進行配制。將實驗室保存的HML366米曲霉菌種，PDA斜面培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.3.4 甘蔗渣酸堿預處理 乙酸處理：稱取6 g過80目篩的甘蔗渣粉末于250 mL的三角瓶中，加入40 mL的乙酸水溶液浸泡24 h，8層紗布過濾進行固液分離，蒸餾水洗去殘留在濾渣中的乙酸，烘干之后進行纖維素酶解試驗。

氨水處理：稱取6 g過80目篩的甘蔗渣粉末于250 mL的三角瓶中，分別加入40 mL的氨水溶液浸泡24 h，8層紗布過濾進行固液分離，蒸餾水洗去殘留在濾渣中的氨水，烘干之后進行纖維素酶解試驗。

1.3.5 固體發(fā)酵產酶培養(yǎng)基 6 g經處理過的蔗渣，4 g麩皮，0.5 mL的 Tween 80，向固體培養(yǎng)基中加入 30 mL Mandels溶液，121℃滅菌 20 min，待接種時使用。

1.3.6 接種及固體培養(yǎng)基產酶培養(yǎng) 在無菌超凈工作臺中將一支活化的米曲霉試管種用10 mL生理鹽水洗下制成孢子液。取107個孢子轉入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將接種后的固體產酶培養(yǎng)基放入30℃恒溫搖床中，培養(yǎng)4 d。

酶液的提?。簭暮銣負u床中取出固體產酶培養(yǎng)基，加入50 mL蒸餾水，30℃恒溫搖床1h，8層紗布過濾，4000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，4℃冰箱中保存（赫志軍和李忠興，2002）。

1.3.7 蛋白質含量的測定 用考馬斯亮藍染色法（Bradford 法）[蛋白質定量試劑盒（碧云天）]測定蛋白質含量。

牛血清白蛋白標準曲線的繪制：在試管中分別精確移取牛血清白蛋白標準溶液（0.5 mg/mL BSA）0、1、2、4、8、12、16、20 μL， 加 0.9%NaCl至 20 μL，然后在各支試管中分別加入200 μL Bradford染色液，搖勻，在595 nm波長處測定吸光度（李建武等，1994），以牛血清白蛋白標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線（圖2）。

圖2 牛血清白蛋白標準曲線

2 結果與分析

2.1 不同濃度的Tween 80對產酶的影響 試驗結果顯示，1號管為未添加表面活性劑的空白對照管，2、3、4 號管為添加 0.4%、0.8%、1.2%Tween 80的 3管， 濾紙酶活分別為 1.02、2.75、2.81、2.49 U/mL。試驗中可以明顯的觀察到2、3、4號管顏色均比1號管深，說明試驗所得酶液具有一定的催化活性，且2、3號管顏色逐漸加深，濾紙酶活也逐漸增大，但4號管的濾紙酶活卻比3號管的小，說明Tween 80可以增加酶的產量，提高酶活，但濃度提高到1.2%時抑制了部分酶活。

2.2 不同濃度的Tween 80對預處理蔗渣產酶的影響 由圖3可以看出，加入不同濃度的Tween 80對經5%氨水和乙酸處理過的蔗渣濾紙酶活的影響較為顯著，蔗渣經5%氨水處理后，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活可達到6.6 U/mL。蔗渣經5%乙酸處理后，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活為6.3 U/mL。經10%乙酸處理過的蔗渣，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活為 6.1 U/mL。當Tween 80濃度增加到1.2%時，濾紙酶活有所下降。其他處理方式結果相近。

圖3 不同濃度的Tween 80對預處理蔗渣產酶的影響

2.3 發(fā)酵液中蛋白質含量結果分析 由圖4可以看出，加入不同濃度的Tween 80對經5%氨水和乙酸處理過的蔗渣產蛋白質的影響較為顯著，蔗渣經5%氨水處理后，添加0.8%Tween 80時，蛋白質含量最高為14.6 mg/mL，空白對照組的蛋白質含量為4.0 mg/mL，提高了3.65倍。蔗渣經5%乙酸處理后，添加0.8%Tween 80的蛋白質含量可以達到12.6 mg/mL。經10%乙酸處理過的蔗渣，添加0.8%Tween 80的蛋白質含量可以達到11.0 mg/mL。產蛋白質較多的處理方式，對應酶活也較高。所有不同方法預處理的蔗渣材料，添加0.4%～0.8%的表面活性劑時蛋白質含量相對較高，增加到1.2%時，含量有所減小，與濾紙酶活檢測結果相對應。

圖4 不同預處理后發(fā)酵液中蛋白質含量

3 討論

本試驗以米曲霉HML366為出發(fā)菌株，研究不同預處理方法及表面活性劑對米曲霉固體發(fā)酵產纖維素酶的影響。蔗渣經5%氨水、5%乙酸、10%乙酸處理后，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活分別可以達到6.6、6.3 U/mL和6.1 U/mL。當Tween 80濃度增加到1.2%濃度時，濾紙酶活有所下降。預處理過的蔗渣及添加Tween 80經發(fā)酵后，其發(fā)酵液中蛋白質含量較高，酶活較高。

添加有Tween 80到未處理的甘蔗渣發(fā)酵后的濾紙酶活比未添加Tween 80也未處理的發(fā)酵液濾紙酶活高，蛋白質含量高，說明表面活性劑Tween 80對產纖維素酶合成有促進作用。蔗渣經過預處理發(fā)酵液的濾紙酶活比未處理過的高。加入較多表面活性劑抑制了部分酶活力,可能是過量加入表面活性劑會使表面活性劑聚合成為膠束，表面張力不能進一步下降或者是表面活性劑的濃度過大時，膜可以解體，透性大增，使細胞內電解質大量外滲，加上細胞內各細胞器膜被破壞，各種代謝失調甚至死亡，產酶活力受到抑制。Tween 80在培養(yǎng)基中的用量為0.4%時對產酶有顯著的促進作用，用量提高到0.8%酶活有所提高，所以Tween 80在培養(yǎng)基中的用量以0.4%～0.8%為佳。

表面活性劑在產酶過程中往往有特殊的作用，因而在酶劑工業(yè)常常得到應用，其主要作用是提高細胞質膜的通透性，有利于胞外酶的不斷排出（姚蘭等，2012）。表面活性劑可以降低纖維素的表面張力，提高纖維素這種高分子聚合物的親水性，使其更易與纖維素酶結合,提高酶的降解效率。此外表面活性劑還降低了溶液的表面張力，從而使纖維素酶在整個反應體系中分散得更均勻，并能促進酶與底物的結合，因此可以提高纖維素酶活力。

本文通過研究表面活性劑協(xié)同酸堿預處理對木質纖維素原料的作用效果，通過添加非離子表面活性劑Tween 80的方法來阻止木質素對纖維素酶的無效吸附，從而提高纖維素酶的催化活性，探究表面活性劑對纖維素酶催化的作用機制，充分利用甘蔗渣等豐富而又廉價的資源來生產乙醇，降低生產成本，具有良好的經濟效益和社會效益。