謝云波，張紀(jì)元，杜美玲，孟繁平，福軍亮，劉利敏，王松山，曲 芮，廉 方，喬 菲，陳楊柳，高瑩瑩，徐若男，施 明，王福生

(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染性疾病診療與研究中心， 北京 100039)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)目前是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因，NK細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分，在清除病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。在慢性肝炎發(fā)展為肝癌的過(guò)程中，NK細(xì)胞功能缺陷與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，同時(shí)也是造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要原因[1]。與正常肝組織相比，肝細(xì)胞癌患者瘤內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量降低、細(xì)胞亞群分布改變，識(shí)別和殺傷肝癌細(xì)胞的功能降低[2-3]。近期研究表明，自體NK細(xì)胞治療在多種實(shí)體瘤的治療中可以提高外周循環(huán)中NK細(xì)胞的活性和數(shù)量，但由于很難遷移到腫瘤部位發(fā)揮功能，臨床療效有限[4-5]。同種異體NK細(xì)胞治療近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于各種臨床試驗(yàn)。殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)不匹配可以抑制自體組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility conplex, MHC)分子的負(fù)向調(diào)控信號(hào)，保證足夠的NK細(xì)胞活化。在急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)患者中，來(lái)自KIR不匹配供體的NK細(xì)胞過(guò)繼回輸可顯著降低造血干細(xì)胞移植后的復(fù)發(fā)率[6]。本研究以患者的健康直系血親為供者，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并進(jìn)行NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的第14、15天，分2次回輸給患者，通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行隨訪，同時(shí)評(píng)估同種異體NK細(xì)胞治療的安全性和有效性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年4月至2017年10月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心收治的HCC患者。

患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡16～65歲的男性或女性患者；(2)按照《原發(fā)性肝癌診療標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》， 患者經(jīng)病理學(xué)和影像學(xué)確診為原發(fā)性肝細(xì)胞癌；肝功能Child-Pugh A/B級(jí) (5～9分)，美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(eastern cooperative oncology group score standard, ECOG)評(píng)分≤ 2分；(3)血小板計(jì)數(shù)>60×109/L；血紅蛋白>80 g/L；凝血：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(international normalized ratio, INR)<2.3，或者凝血時(shí)間延長(zhǎng)<6 s；血清白蛋白>28 g/L,總膽紅素<51 mmol/L，谷丙/谷草轉(zhuǎn)氨酶<5倍正常值上限；(4)合并乙肝患者進(jìn)行抗病毒治療，合并丙肝患者服用直接抗病毒(direct-acting antiviral agents, DAA)藥物治療。供者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～40 歲的男性或女性且為患者直系血親；(2)理解并簽署知情同意書，且遵循自愿、無(wú)償?shù)脑瓌t；(3)排除糖尿病、高血壓、心臟病等慢性疾病，全身無(wú)其他重大器質(zhì)性疾病和傳染性疾病；(4)沒(méi)有精神障礙，具有完全的行為能力。

患者排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠或哺乳期婦女；(2)器官移植后患者；(3)2 周內(nèi)進(jìn)行過(guò)介入微創(chuàng)治療術(shù)或者1 個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過(guò)切除手術(shù)的患者；(4)合并甲型肝炎、戊型肝炎、艾滋病等感染者，或有其他傳染性疾??；(5)合并其他嚴(yán)重的全身性疾病和精神病患者；(6)篩選前30 d內(nèi)發(fā)生過(guò)急性感染、消化道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥；(7)半年內(nèi)進(jìn)行過(guò)其他生物治療，包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells, CIK)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cells, CAR-T)、程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1, PD-1)和其他免疫治療的患者。

共入組HCC患者21例，其中男性18例，女性3例，基線資料見表1。本項(xiàng)臨床研究通過(guò)中國(guó)人民解放軍第三零二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有入組患者和供者均理解并簽署知情同意書。

表1 患者的人口學(xué)和基線特征Table 1 Demographic and baseline characteristics of the patients

ECOG, eastern cooperative oncology group score standard; BCLC, Barcelona clinic liver cancer.

1.2 細(xì)胞制備及質(zhì)控

包被：取NK細(xì)胞激活劑2 mL至175 cm2培養(yǎng)瓶中，加入20 mL生理鹽水充分混勻并置于4 ℃冰箱過(guò)夜。

外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分離：采集供者外周血50～80 mL，通過(guò)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，800 ×g，25 min；收集上層血漿并于56 ℃滅活30 min；收集單核細(xì)胞層細(xì)胞，加入生理鹽水重懸，300 ×g，10 min洗滌2次。

細(xì)胞培養(yǎng)：用10 mL生理鹽水沖洗包被的培養(yǎng)瓶，將PBMC重懸于NK細(xì)胞活化培養(yǎng)基中，使其密度為1×106/mL，分別按照終濃度為50 μg/L、1 000 IU/mL和2.5%分別加入重組人IL-15、重組人IL-2和滅活血漿，混勻后接種于包被培養(yǎng)瓶中；置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并加入擴(kuò)增培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×105～8×105/mL，按照初始培養(yǎng)濃度加入細(xì)胞因子和滅活血漿，每2～3天傳代1次。

細(xì)胞收獲：培養(yǎng)14 d和15 d后，用生理鹽水重量細(xì)胞300 ×g，8 min洗滌細(xì)胞2次，用含1%(體積分?jǐn)?shù))注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細(xì)胞，經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至輸液袋。

細(xì)胞質(zhì)控：分別于培養(yǎng)第0、7、14天取細(xì)胞培養(yǎng)懸液進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)檢內(nèi)容包括微生物學(xué)安全性(細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測(cè))和生物學(xué)活性(細(xì)胞活率、NK細(xì)胞純度、NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平、NK細(xì)胞殺傷功能檢測(cè))。

1.3 隨訪檢查

首次NK細(xì)胞治療開始后4周、8周、12周、24周、36周、48周定期隨訪。隨訪觀察指標(biāo)包括安全性指標(biāo)(發(fā)熱及其他不適、血常規(guī)、肝腎功能、心電圖)和有效性指標(biāo)(臨床癥狀及體征、腫瘤標(biāo)志物水平、生物化學(xué)指標(biāo)、影像學(xué)指標(biāo)、免疫學(xué)指標(biāo)及生活質(zhì)量評(píng)價(jià))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 同種異體NK細(xì)胞治療安全性評(píng)價(jià)

21例患者中，10例患者治療1療程，5例患者治療2療程，5例患者治療3療程。所有患者未見惡心、嘔吐、感染、過(guò)敏、昏迷、急性和慢性移植物抗宿主反應(yīng)(graft-versus-host disease, GVHD)。10例患者在細(xì)胞輸注后24 h內(nèi)出現(xiàn)短暫發(fā)熱反應(yīng)，其中9例患者體溫為37.3～38.5 ℃，1例患者體溫為38.5～39.5 ℃。1例患者接受NK細(xì)胞治療12 h后出現(xiàn)輕微肝痛，1例患者出現(xiàn)輕微頭痛。以上所有患者的癥狀均在8 h內(nèi)自然緩解，無(wú)需治療。結(jié)果表明，該劑量的NK細(xì)胞治療不超過(guò)患者的耐受限度。

在1年的隨訪中，同種異體NK細(xì)胞治療后3個(gè)月內(nèi)患者淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療3個(gè)月后淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)至治療前水平，6個(gè)月后淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)高于基線，然后緩慢恢復(fù)到原水平。中性粒細(xì)胞和血小板水平無(wú)明顯變化。治療后患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin, TBil)、白蛋白(albumin, ALB)均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，與基線比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)水平較NK細(xì)胞治療前顯著降低。

2.2 同種異體NK細(xì)胞治療療效評(píng)價(jià)

按照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST)1.1標(biāo)準(zhǔn)[7]， 21例同種異體NK細(xì)胞治療的HCC患者1年隨訪中，1例(4%)完全緩解，3例(12%)部分緩解，12例(52%)病情穩(wěn)定。所有患者的總疾病控制率為76.2%(表2)，其中BCLC(Barcelona clinic liver cancer) A期患者中疾病控制率為100%, SD 10例；BCLC B期患者中疾病控制率為60%，部分緩解(partial response, PR) 1例，SD 2例；BCLC C期患者中疾病控制率為50%，完全緩解(complete response, CR) 1例，PR 2例。截至2019年5月，接受同種異體NK細(xì)胞治療的21例患者中有5例死亡。死亡患者中BCLC C期患者3例，存活時(shí)間分別為3個(gè)月、4個(gè)月和4個(gè)月；BCLC B期患者2例，存活時(shí)間分別為4個(gè)月后、10個(gè)月。

表2 NK細(xì)胞治療療效評(píng)價(jià)Table 2 Summary of efficacy measures

2.3 同種異體NK細(xì)胞治療后外周免疫變化

同種異體NK細(xì)胞過(guò)繼回輸后24 h，患者CD4+ T細(xì)胞的頻率和CD4/CD8比值較基線顯著升高(圖1)，而NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的頻率較基線顯著下降，B細(xì)胞頻率較治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮到所培養(yǎng)的NK細(xì)胞和患者PBMC存在互相殺傷的可能，分別以患者PBMC和供者培養(yǎng)后的NK細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否加入IL-2，供者培養(yǎng)后的NK細(xì)胞對(duì)患者PBMC均無(wú)殺傷作用，但具有正常殺傷腫瘤細(xì)胞系的能力。

*P<0.05, ☆P<0.001.圖1 NK細(xì)胞治療24 h后患者外周血淋巴細(xì)胞亞群變化Figure 1 Changes in the proportion of lymphocyte subsets 24 h after treatment

3 討論

早期的基礎(chǔ)研究顯示,在造血干細(xì)胞移植和骨髓移植過(guò)程中CD56(bright) NK細(xì)胞的百分比與GVHD的發(fā)生密切相關(guān),當(dāng)移植物中CD56(bright) NK細(xì)胞超過(guò)3%時(shí)，GVHD發(fā)生的概率接近于零[8-10]。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)NK細(xì)胞的中位頻率為80%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)造血干細(xì)胞移植和骨髓移植中CD56(bright) NK細(xì)胞的頻率，但在本試驗(yàn)研究的1年隨訪過(guò)程中，研究沒(méi)有觀察到急性和慢性GVHD的發(fā)生，提示同種異體NK細(xì)胞在原發(fā)肝癌的臨床應(yīng)用中有很好的安全性。本研究結(jié)果顯示，疾病控制率與同種異體NK細(xì)胞治療的療程有關(guān)，治療的療程數(shù)越多，疾病控制率越高，提示異體NK細(xì)胞在患者體內(nèi)存在半衰期，多次治療可能會(huì)提高治療療效,但由于本臨床試驗(yàn)樣本量較小，難以控制和調(diào)整混雜因素，這一結(jié)果還需要通過(guò)大樣本臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究檢測(cè)了同種異體NK細(xì)胞過(guò)繼輸注后HCC患者外周血淋巴亞群的變化，發(fā)現(xiàn)雖然短期內(nèi)輸入了了大量的外源性NK細(xì)胞，但患者外周血中NK細(xì)胞的數(shù)量和頻率仍然低于治療前水平。同種異體NK細(xì)胞輸注后患者外周血CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量在24 h內(nèi)降至最低，B細(xì)胞在48 h內(nèi)降至最低，1周后逐漸恢復(fù)至正常水平，這一結(jié)果與Qin等[11]的報(bào)道相反。本研究將培養(yǎng)的NK細(xì)胞與未處理的HCC患者PBMC體外共培養(yǎng)24 h，未觀察到培養(yǎng)的NK細(xì)胞對(duì)患者PBMC的殺傷作用，也未觀察到患者PBMC對(duì)培養(yǎng)NK細(xì)胞的殺傷作用，這一結(jié)果可能與Miller等[12]報(bào)道的單倍體NK細(xì)胞過(guò)繼回輸后異體NK細(xì)胞在患者體內(nèi)嵌合現(xiàn)象有關(guān)。本研究推測(cè)，大劑量同種異體CD56(bright) NK細(xì)胞過(guò)繼輸注后，可能通過(guò)分泌細(xì)胞因子激活患者的自然免疫和特異性免疫，誘導(dǎo)患者特異性CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞向腫瘤部位遷移，改變腫瘤局部微環(huán)境并殺傷腫瘤細(xì)胞。

本研究6例晚期肝癌患者1例治療后完全緩解，回顧分析發(fā)現(xiàn)該患者在接收同種異體NK細(xì)胞治療同時(shí)也接受索拉非尼治療，提示同種異體NK細(xì)胞聯(lián)合索拉非尼可能會(huì)延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。索拉非尼是晚期HCC的靶向治療藥物，據(jù)Llovet等[13]在NEnglJMed報(bào)道，索拉非尼可使晚期HCC患者的中位生存期延長(zhǎng)近3個(gè)月，但在299例單用索拉非尼治療的患者中，沒(méi)有一例患者達(dá)到CR?；仡?012—2018年在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染性疾病診療與研究中心接受索拉非尼治療的患者，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CR病例。此外，索拉非尼的副作用和耐藥性仍然存在，這極大地限制了索拉非尼的臨床應(yīng)用。既往研究表明[14-15]，索拉非尼可觸發(fā)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage, TAM)的促炎活性，繼而誘導(dǎo)抗腫瘤NK細(xì)胞反應(yīng)，提示NK細(xì)胞治療聯(lián)合索拉非尼可使患者獲得更好的臨床療效。在研究3例同種異體NK細(xì)胞聯(lián)合索拉非尼患者的總生存時(shí)間分別為16個(gè)月、19個(gè)月、32個(gè)月，均存活到2019年5月，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)報(bào)道的10.3個(gè)月，提示同種異體NK細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼在晚期肝癌的治療中可能具有巨大的潛力。

綜上所述，同種異體NK細(xì)胞治療HCC有很好的安全性和有效性，對(duì)延長(zhǎng)患者生存時(shí)間、提高生活質(zhì)量可能具有良好的治療前景。但仍需要進(jìn)一步通過(guò)大樣本、多中心、隨機(jī)對(duì)照研究評(píng)估同種異體NK細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼治療晚期肝癌的療效。