肖裕章 ,畢海林 ,張 超 ,袁啟峰 ,胡 軍 ,陳匯鑫 ,唐建華,

(1.重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司,重慶榮昌402460 ;2.西南大學(xué)榮昌校區(qū),重慶榮昌 402460)

磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine,SMM)在動(dòng)物體內(nèi)外都具有很強(qiáng)的抗菌活性,是磺胺類中抗菌作用最強(qiáng)的一種,且對(duì)大多數(shù)革蘭陽性菌和陰性菌都有較強(qiáng)的抑制作用,細(xì)菌對(duì)此藥產(chǎn)生耐藥性較慢[1],是一種廣譜抗菌藥,其作用機(jī)制主要是與對(duì)氨基苯甲酸(PABA)競(jìng)爭(zhēng)性作用于細(xì)菌體內(nèi)的二氫葉酸合成酶,阻止葉酸的合成,減少具有代謝活性的四氫葉酸的量,從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。SMM 口服后經(jīng)胃腸道吸收良好,血液中濃度較高,乙?；实?乙?；镌谀蛑腥芙舛却?不易引起結(jié)晶尿和血尿,能用于由敏感菌引起的各種疾病,對(duì)豬弓形蟲病,禽、兔球蟲病的療效也是非常明顯的[1]。

目前國內(nèi)獸醫(yī)臨床上所使用的磺胺藥劑型比較少,大都是中、短效類制劑,長(zhǎng)效類制劑在市面上較少且經(jīng)常出現(xiàn)刺激性大等不良反應(yīng),所以磺胺類長(zhǎng)效制劑是目前獸藥研發(fā)針對(duì)短板解決問題迫在眉睫的有效途徑之一。為了延長(zhǎng)SMM 注射液的持效時(shí)間,減少臨床治療周期,重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司對(duì)此研制出了一種具有長(zhǎng)效性的磺胺間甲氧嘧啶注射液,它不僅能快速釋放藥物,還能較長(zhǎng)時(shí)間的維持有效濃度,且刺激小,用藥周期短,能更好地起到療效,減少細(xì)菌對(duì)藥物的耐藥性。為了更能突出新研制SMM 注射液的優(yōu)勢(shì),與常規(guī)SMM 注射液在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程參數(shù)進(jìn)行比較,為臨床應(yīng)用以及產(chǎn)品開發(fā)提供試驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 SMM-Na 注射液A、B,兩種產(chǎn)品均由重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供;SMM 對(duì)照品(批號(hào)C0031610,含量為99.5%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;甲醇:色譜級(jí),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;乙腈:色譜級(jí),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;磷酸:分析純,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;N-N-二甲基甲酰胺:分析純,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;乙腈:分析純,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;水:屈臣氏蒸餾水,廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器設(shè)備 安捷倫1260 高效液相色譜儀:四元泵VL:G7129A;DAD 檢測(cè)器:G7115A;自動(dòng)進(jìn)樣器:G7111A;LC1260 色譜工作站。TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī):上海菲恰爾分析儀器有限公司;XW-80A 漩渦混合器:上海青浦滬儀器廠;80-2 臺(tái)式低速離心機(jī):上海手術(shù)器械廠;移液槍:上海求精生化試劑儀器有限公司;BP211D 電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 榮昌雜交健康豬10 頭,公母各半,近期無用藥史,體重(20.67 ±3.07)kg,由重慶市畜牧科學(xué)院實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)提供,試驗(yàn)期間單獨(dú)分籠飼喂不含抗生素的全價(jià)飼料,自由飲水及采食,試驗(yàn)前2 周打耳號(hào)、分組、采血。檢測(cè)結(jié)果所有試驗(yàn)豬不含磺胺間甲氧嘧啶。

1.4 給藥和血樣采集 榮昌雜交健康豬10 頭,公母各半,平均體重為(20.67 ±3.07)kg,隨機(jī)分成2 組,每組5 頭,按50 mg/kg·bw 劑量分別在耳后方頸部肌肉注射磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液A、B。給藥前采一次空白血樣,給藥后分別于0.25、0.5、1、2、3、5、7、9、12、24、36、48、72 h 自前腔靜脈采集血樣,采血量為2～3 mL 置于含肝素鈉的離心管中,輕輕旋轉(zhuǎn)混勻,防止凝固,在4 000 r/min 的離心機(jī)中離心10 min,分離血漿,-20 ℃保存待測(cè)。

1.5 血漿樣品的處理 準(zhǔn)確取新鮮或解凍血漿樣品800 μL 于2.5 mL 帶蓋聚丙烯的離心管中,加入乙腈800 μL,旋渦混勻1 min,以16 000 r/min 離心15 min,取全部上清液經(jīng)0.2 μm 微孔濾膜后,進(jìn)行HPLC 測(cè)定分析。

1.6 HPLC 測(cè)定色譜條件及溶液的配制 色譜條件:色譜柱Welch Uitimate?XB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動(dòng)相:0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20);柱溫:40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):271 nm;流速:1.0 mL/min。對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備:取SMM 對(duì)照品適量,精密稱定,加入少量的N-N-二甲基甲酰胺溶解后,加乙腈制成每1 mL 含SMM 1.0 mg 溶液,即得。0.1%的磷酸溶液:精密移取磷酸1 mL 于1 000 mL 容量瓶中,加蒸餾水混勻后并定容即得。流動(dòng)相:取0.1%的磷酸溶液800 mL 和200 mL 乙腈,混勻,過? 0.2 μm微孔濾膜,超聲脫氣,待用。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備:精密取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL 分別置于10 mL 容量瓶中,加乙腈定容制成0.05、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。過? 0.2 μm 微孔濾膜,即可進(jìn)樣。血樣加樣回收率溶液的制備:設(shè)置高、中、低3 個(gè)不同的濃度進(jìn)行加樣回收率測(cè)定,取12 份400 μL 空白血樣分成高、中、低3 組,每組4 份,分別精密移取200 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為50.00 μg/mL、10.00 μg/mL、5.00 μg/mL 于各組血樣中,再在每組血樣中加入乙腈使之制成高濃度組濃度為12.50 μg/mL,中濃度組濃度為2.50 μg/ mL,低濃度組濃度為1.25 μg/mL 的溶液,過? 0.2 μm 微孔濾膜,即可進(jìn)樣。

1.7 數(shù)據(jù)分析 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用3P97 藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序處理。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系與回收率

2.1.1 線性關(guān)系 對(duì)SMM 對(duì)照品、空白血樣、添加樣品及給藥后血漿樣品進(jìn)行液相色譜分析,得到圖譜(見中插彩版圖1)。SMM 與雜質(zhì)分離度好,無干擾峰,峰形較好,保留時(shí)間在13 min 左右。在試驗(yàn)前,對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行了方法驗(yàn)證,在0.05～100.00 μg/mL 范圍內(nèi),以0.05、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 μg/mL 7 個(gè)濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,并以樣品濃度和吸收峰面積作線性回歸(見圖2),得出回歸方程為Y=71.64X -46.43,相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 8。

圖1 豬血漿中SMM 的HPLC-DAD(271 nm)色譜分析

2.1.2 回收率 以濃度1.25、2.50、12.50 μg/mL的SMM 血樣添加樣品測(cè)定回收率,結(jié)果見表1。檢測(cè)限(S/N=3)為0.025 μg/mL,定量限(S/N=10)為0.05 μg/mL。日內(nèi)變異系數(shù)小于5.26%,日間變異系數(shù)小于4.85%。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=12)

圖2 線性回歸圖

2.2 血藥濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.2.1 SMM 在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 以50 mg/kg·bw 的劑量給2 組豬肌肉注射后,制劑A、B 在豬體內(nèi)的血藥濃度隨時(shí)間變化情況見表2,藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3,藥時(shí)曲線見圖3,由表可知:A、B制劑的半衰期t1/2β分別為(20.75 ±1.29)h、(6.73±1)h,達(dá)峰時(shí)間分別為T(peak)=(2.15 ±0.12)h、T(peak)=(0.42 ±0.05)h,C(max)分別為(146.98 ±7.61)μg/mL、(270.83 ±16.71)μg/mL,48 h 時(shí),A 制劑在豬體內(nèi)的血藥濃度降到(8.61 ±0.66)μg/mL,B制劑在豬體內(nèi)的血藥濃度未檢測(cè)到。

表2 2 種制劑給豬肌注50 mg/kg·bw 后SMM 在豬體內(nèi)隨時(shí)間變化的血藥濃度 (μg/mL)

表3 2 種制劑給豬肌肉注射50 mg/kg·bw 后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=5)

圖3 肌肉注射后血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

3.1 SMM 藥代動(dòng)力學(xué) SMM 的抗菌作用相比其他相同類型的藥物強(qiáng),SMM 吸收后分布于全身組織以及體液,在腎、肝、尿液中含量最高,且在尿和血中的乙?；识急容^低,但不同劑型、不同給藥方式、不同劑量以及不同種屬,甚至同種劑型不同制劑輔料和技術(shù),其抗菌作用、藥代動(dòng)力學(xué)特征也存在差異。如在人體口服用藥1 g,其半衰期為36 -48 h,在4 h 血藥濃度才達(dá)到最高[2],屬于一種長(zhǎng)效類藥物。而對(duì)于動(dòng)物,大量文獻(xiàn)資料顯示,家禽類對(duì)SMM 吸收率最高,肉雜食動(dòng)物要比草食動(dòng)物吸收率高,單胃動(dòng)物吸收率高于復(fù)胃動(dòng)物吸收率且犬>豬>馬>羊>牛。給兔以SMM 50 mg/kg·bw 單劑量快速靜脈注射其半衰期為2.08 h[3];口服200 mg/kg·bw SMM 后血漿半衰期為2.87 h[4]。奶山羊的半衰期為1.45 h[5];水牛24 h,綿羊2 h,山羊7 h,豬5.8 h[1]。以化膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺膜炎雙球菌、大腸桿菌為例,SMM 血中有效濃度分別為0.5μg/mL、8μg/mL、0.25 μg/mL、8 μg/mL。以SMM 50 mg/kg·bw 肌肉注射劑量制劑A 有效血液濃度可維持時(shí)間48 h 以上,制劑B 有效血液濃度可維持時(shí)間36 h 以上,在獸醫(yī)臨床上給豬一般采用肌肉注射的方式進(jìn)行給藥,其平均半衰期為16.9 h,遠(yuǎn)大于靜脈注射給藥。由此可見,在大部分家畜體內(nèi)的半衰期都比較短,為短效類。本試驗(yàn)結(jié)果表明,制劑A 的消除半衰期為(20.75 ±1.29)h,制劑B 的消除半衰期為(6.73 ±1)h,有效血液濃度持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),能夠起到更好的治療效果且制劑A 肌肉注射給藥具有延緩吸收的作用,可達(dá)到緩釋的效果;而制劑B 作用效果快,但有效血液濃度維持短,在臨床治療上需要多次注射才能達(dá)到治療要求,增加了復(fù)雜性。

3.2 關(guān)于血樣未測(cè)到檢測(cè)限的問題 檢測(cè)限為0.025 μg/mL,在48 h、36 h 分別所測(cè)的血樣濃度要遠(yuǎn)高于檢測(cè)限,而在72 h 和48 h 卻未檢測(cè)到血藥濃度,可能是在24 h 和12 h 之內(nèi)已被代謝完全,在第72 h 和48 h 無法檢測(cè)到血藥濃度,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6]的結(jié)果有一致性。另外檢測(cè)限表示的是方法和儀器靈敏度的一個(gè)指標(biāo),表示在這個(gè)范圍之內(nèi)的可靠程度,并非所測(cè)樣品要在這個(gè)值上測(cè)定。從藥時(shí)曲線可以看出,制劑A、制劑B 分別在48 h 和36 h之后的時(shí)間血藥濃度是緩緩降低,并非在這時(shí)間點(diǎn)就終止,再往后測(cè)定就沒有實(shí)際意義。

3.3 2 種制劑藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果的討論 根據(jù)結(jié)果表2,應(yīng)用3P97 藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算軟件進(jìn)行計(jì)算,擬合血藥濃度-時(shí)間的曲線,經(jīng)F 檢驗(yàn)表明,制劑A、B 在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)都符合二室模型,這與其他研究者在豬[7]、兔[8]、蝦[9]體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)模型是一致的,均為二室模型,而其他動(dòng)物,像肌肉注射水牛[10]、肌肉注射黑山羊[11]、靜脈注射豬[12]以及奶山羊[5]體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)模型為一室模型,由此可見,SMM-Na 注射液在不同種屬動(dòng)物以及使用不同的給藥方式會(huì)產(chǎn)生不同差異的[13-14]。

根據(jù)結(jié)果表3,比較制劑A、B 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn),兩者之間的AUC、消除半衰期差別比較大,原因可能是兩者制劑的溶媒不一樣,對(duì)主藥的包合程度不一樣,制劑A 以聚乙烯比咯烷酮30 和2-吡咯烷酮作為溶媒,可以與磺胺藥結(jié)合成大分子復(fù)合物,從而在體內(nèi)會(huì)起到一種緩慢釋放的效果[15]。而制劑B 使用的比例較小的同種溶媒,兩者之間在注入動(dòng)物體內(nèi)吸收程度不一樣,制劑B 吸收程度要比制劑A 吸收程度大。結(jié)果表明,2 種注射液的AUC以及消除半衰期具有極顯著差異(P<0.01)。消除半衰期與給藥方式、劑型、劑量、種屬以及同種制劑中不同工藝也有所差異。

由參數(shù)可知,A 制劑明顯比B 制劑更長(zhǎng)效,作用時(shí)間更持久,更能到達(dá)治療的效果。制劑A 按50 mg/kg·bw 的給藥劑量在豬體內(nèi)的有效血液濃度可以維持48 h 以上,由此建議,在臨床治療上按50 mg/kg·bw 的給藥劑量給豬肌肉注射可2 d 注射1 次即可。