(吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林吉林 132013)

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)是周期非特異性抗腫瘤藥,對多發(fā)性骨髓瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤[1]、卵巢癌、乳腺癌等有效。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其對男性生殖系統(tǒng)有損傷作用并對后代存在潛在致畸風(fēng)險,常作為少精癥和弱精癥模型的誘導(dǎo)劑,它在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時,會導(dǎo)致機(jī)體生精障礙,是制備生精障礙動物模型的理想藥物[2-3]。楊梅黃酮(Myricetin,M)別名楊梅素,是楊梅科楊梅屬植物楊梅的主要成分。研究顯示,楊梅黃酮具有降糖、抗炎[4]、抗腫瘤[5-6]、抗帕金森病[7]、抗疲勞等多種作用。但楊梅黃酮對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠生殖功能障礙拮抗作用的研究并不多,研究楊梅黃酮改善環(huán)磷酰胺化療引起的生殖功能障礙具有重要的理論與實(shí)際意義。本試驗(yàn)通過對環(huán)磷酰胺所致生精障礙的雄性小鼠給予不同劑量的楊梅黃酮灌胃30 d,探討楊梅黃酮對雄性小鼠生殖功能的作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康ICR 小鼠,SPF 級,雄性,18～22 g,由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,動物許可證號SCXK(吉)2016 -0003。

1.1.2 藥品試劑 楊梅黃酮(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%),批號:WZ16025,西安萬滋生物科技有限公司;環(huán)磷酰胺(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),北京華邁科生物技術(shù)有限公司,批號:CO79504;甲睪酮,天津力生制藥股份有限公司,批號:1 602003;乳酸脫氫酶(LDH)、核因子κb(NF-κb)、腫瘤壞死因子α(TNF -α)ELISA 試劑盒,上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司,批號:H18Y11;MDA、微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒,南京建成生物工程公司,批號:20 180412;Bradford 蛋白濃度測定試劑盒,上海碧云天試劑公司。

1.3 儀器 SC -3612 低速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;T10 分散機(jī)(basic ULTRA -TURRAX),德國IKA 公司;HPX -9272MBE 電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;722可見分光光度計(jì),上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品;BioTek ELX800 酶標(biāo)儀,美國博騰儀器有限公司;DP80 型激光共聚焦顯微鏡,日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組和給藥 小鼠72 只,體重18～22 g,隨機(jī)分為6 組:對照組、模型組、楊梅黃酮低、中、高劑量組(ML 組、MM 組、MH 組)、甲睪酮組(T組,10 mg/kg·d),每組12 只。除對照組,各組均腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)50 mg/kg·d,連續(xù)7 d,對照組同時給予等體積生理鹽水腹腔注射,楊梅黃酮組及甲睪酮組自造模2 d開始灌胃給藥,楊梅黃酮組給藥劑量為100、200、400 mg/kg·d,每天1 次,連續(xù)30 d,對照組和模型組每日灌胃等體積的0.25%羧甲基纖維素鈉溶液。

末次給藥后禁食不禁水24 h,小鼠稱體重(BW)后10%水合氯醛(0.3 mL/kg·bw)麻醉,快速取雙側(cè)睪丸和附睪,剝除粘連的血管、韌帶及脂肪等組織,迅速用分析天平稱質(zhì)量、記錄睪丸濕質(zhì)量,稱重后留做組織均漿。腹主動脈取血,留血清備用。每組隨機(jī)挑取小鼠2 只,頸椎脫臼處死之后取出睪丸,4%多聚甲醛固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片備用,用于H.E.染色。

1.2.2 精子密度檢查(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法) 取雙側(cè)附睪迅速置于37.0 ℃2 mL 生理鹽水中,探針充分剝離附睪后,于37.0 ℃恒溫箱中孵育15 min,使精子游出。4 層擦鏡鏡紙過濾,得稀釋的精液。取上述精液100 μL 加3%NaCl 100 μL,混勻后取1 滴滴在蓋玻片的邊緣(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上),精液自行滲入,靜置1～2 min 后,于400 倍光學(xué)顯微鏡下按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)精子數(shù)。對于壓線精子的計(jì)數(shù)是數(shù)頭不數(shù)尾,數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右。

1.2.3 精子畸變試驗(yàn) 取精液1 滴于載玻片上涂片。自然干燥后,再甲醇固定5 min 以上至干燥。用1%伊紅染色1 h,用水輕沖多余染劑,干燥。置于鏡下統(tǒng)計(jì)精子畸變數(shù)目,每張片子計(jì)數(shù)1 000 個精子。為了減少誤差,對同一個樣品應(yīng)進(jìn)行2 次精子數(shù)量檢查,求其平均數(shù)。

1.2.4 血清GSH 含量的檢測 取血清,嚴(yán)格按試劑盒說明用酶標(biāo)儀檢測血清中GSH 含量。

1.2.5 睪丸組織MDA、TNF -α、NF -kb 含量及LDH 活性的測定 取睪丸組織,用生理鹽水在冰浴下制成10% 組織勻漿,4 ℃,4 000 r/min 離心15 min,取上清液嚴(yán)格按試劑盒說明書(采用硫代巴比妥酸法)測定MDA 含量,檢測組織蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。取10%小鼠睪丸組織勻漿,嚴(yán)格按照試劑盒說明用酶標(biāo)儀測定TNF -α 及NF -κb 含量。取10%睪丸組織勻漿上清液稀釋為1%,嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定LDH 水平。

1.2.6 睪丸H.E.染色 將睪丸于4%多聚甲醛固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片備用,用于H.E.染色,光學(xué)顯微鏡下觀察,并拍照。

2 結(jié)果

2.1 楊梅黃酮對CTX 誘導(dǎo)生精障礙小鼠的精子密度及精子畸變率的影響 結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠精子密度明顯下降、精子畸形率顯著增加(P<0.01),說明CTX 影響小鼠的精子生成過程,精子的形成和成熟受到干擾。各劑量楊梅黃酮、甲睪酮處理后,精子密度增加,且精子畸形率降低,楊梅黃酮中、高劑量組及甲睪酮組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05 或P<0.01)。可見楊梅黃酮對CTX 所致雄性小鼠生殖毒性有改善作用,見圖1、圖2。

圖1 楊梅黃酮小鼠精子密度的影響

圖2 楊梅黃酮對小鼠精子畸形率的影響

2.2 楊梅黃酮對CTX 誘導(dǎo)生精障礙的小鼠血清中GSH 及睪丸組織中MDA、LDH 水平的影響 結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠血清中GSH 含量降低、睪丸組織中MDA 含量顯著性增高,睪丸組織中LDH 活性降低(P<0.05 或P<0.01),說明CTX 對小鼠生殖系統(tǒng)引起氧化應(yīng)激損傷,從而影響了精子生成功能酶的活性,同時可見中、高劑量的楊梅黃酮治療后血清中GSH 含量增高,各劑量的楊梅黃酮治療后睪丸組織MDA 含量降低、LDH 活性增高,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05 或P<0.01),說明楊梅黃酮有一定的清除氧自由基、抗氧化作用,見圖3、圖4、圖5。

圖3 楊梅黃酮對小鼠血清GSH 含量的影響

圖4 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織MDA 含量的影響

圖5 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織MDA 含量的影響

2.3 楊梅黃酮對CTX 誘導(dǎo)生精障礙的小鼠睪丸組織中TNF -α 及NF -κB 含量的影響 結(jié)果表明,模型組小鼠睪丸組織中TNF -α 及NF -κB 含量高于對照組(P<0.05 或P<0.01);與模型組比較,楊梅黃酮中、高劑量組及甲睪酮組睪丸組織中TNF-α及NF-κB 含量減少,楊梅黃酮中、高劑量組及甲睪酮組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05 或P<0.01),見圖6、圖7。

圖6 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織TNF-α 含量的影響

圖7 楊梅黃酮對小鼠睪丸組織NF-κB 含量的影響

2.4 楊梅黃酮對CTX 誘導(dǎo)生精障礙的小鼠睪丸組織病理改變的影響 H.E.染色睪丸組織切片:對照組睪丸生精小管排列密集,生精上皮厚,生精細(xì)胞層次和數(shù)量多,生精小管腔均見精子形成;與對照組比較,模型組睪丸多數(shù)生精小管直徑明顯變細(xì),間距較寬,生精上皮明顯變薄,生精細(xì)胞層次和數(shù)量減少,多數(shù)生精小管腔未見精子形成,管腔內(nèi)可見脫落的生精細(xì)胞;與模型組比較,楊梅黃酮給藥組、甲睪酮組生精上皮增厚,生精細(xì)胞層次和數(shù)量明顯增多,以楊梅黃酮高劑量組尤為明顯(見中插彩版圖8)。

圖8 睪丸組織結(jié)構(gòu)變化 (H.E.染色,100 ×)

3 討論

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX) 屬于烷化劑,可以與DNA 形成交聯(lián),抑制DNA 合成,從而抑制細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。目前研究認(rèn)為,環(huán)磷酰胺致生精功能損害的機(jī)制可能是環(huán)磷酰胺經(jīng)肝微粒體P450 酶系代謝生成有毒的親電子物質(zhì)如丙烯醛、4 -羥化物和氯乙醛,這些產(chǎn)物導(dǎo)致自由基清除酶活性下降,造成自由基蓄積,影響類固醇激素合成酶的活性,并引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng),使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,造成生殖細(xì)胞損傷,使精子微環(huán)境發(fā)生改變。因此尋找與開發(fā)可有效地防治氧化應(yīng)激造成的生殖細(xì)胞損傷的天然化合物,延緩生精功能損傷成為共識。楊梅黃酮(Myricetin)是從楊梅科屬植物的葉、皮及根中提取出來的一種黃酮類化合物,臨床上可用于消炎、抗氧化、止痛、降低血糖和保護(hù)肝臟等多種治療。由于其豐富的資源優(yōu)勢和巨大的潛在藥用價值,目前已有多種楊梅黃酮保健品上市。楊梅黃酮屬于多酚類天然化合物,研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、延緩衰老和保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種藥理作用。因楊梅黃酮結(jié)構(gòu)中具有多個酚羥基而具有天然抗氧化活性之功效。本課題組研究發(fā)現(xiàn)藥物楊梅黃酮在保護(hù)生精功能方面也有明顯的效果[8]。目前有關(guān)楊梅黃酮在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠生精障礙的保護(hù)作用及機(jī)制還未見報道。本試驗(yàn)采用腹腔注射50 mg/kg·bw 環(huán)磷酰胺連續(xù)7 d 建立生精障礙動物模型,然后給予楊梅黃酮進(jìn)行干預(yù)和研究。

乳酸脫氫酶(LDH)是生精細(xì)胞糖代謝功能的主要酶,LDH 的活性與生精上皮成熟及精子活動、獲能及受精密切相關(guān),是評價生精能力的重要指標(biāo)[9]。還原型谷胱甘肽(GSH)可以非酶促反應(yīng)的形式直接與氧自由基結(jié)合,達(dá)到清除氧自由基的目的,是抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)是反映機(jī)體內(nèi)活性氧水平的較好指標(biāo),活性氧對生殖細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激損傷,破壞精子質(zhì)膜的流動性,引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞受損傷和精子生成異常,從而使生精功能減弱及精子質(zhì)量下降[10]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予楊梅黃酮預(yù)防治療后,精子密度升高,且精子畸形率降低,睪丸組織中LDH、GSH 水平增高、MDA 含量降低,楊梅黃酮組睪丸組織病理與模型組比較,生精上皮增厚,生精細(xì)胞層次和數(shù)量明顯增多,由此可見,楊梅黃酮可通過抗氧化作用改善生精功能,對環(huán)磷酰胺所致的生精障礙具有防治作用。

氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切相關(guān),氧化應(yīng)激可觸發(fā)多種調(diào)控細(xì)胞內(nèi)炎性因子的信號通路,誘發(fā)炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子-α(TNF -α)主要由巨噬細(xì)胞分泌,作為活性氧(ROS)和活性氮(RNS)生成調(diào)節(jié)因子,在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、平衡細(xì)胞存活與細(xì)胞凋亡中起著重要作用[11]。核因子(NF -κB)是一種參與免疫反應(yīng)、炎癥、胚胎發(fā)育、組織損傷修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)重要的基因調(diào)控因子,正常情況下,NF-κB 以無活性的三聚體形式(p50、p65 及抑制因子IκB)存在細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞受到TNF -α、IL -1β及內(nèi)毒素等刺激時,IκB 被降解后NF-κB 與IκB 發(fā)生解離而激活,活化的NF -κB 進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用,其會導(dǎo)致多種自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]、動脈硬化、炎性腸病等。本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠睪丸組織中TNF -α 及NF -κb 含量高于對照組,同時楊梅黃酮中、高劑量組睪丸組織中TNF-α及NF -κb 含量減少,與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明楊梅黃酮具有抗炎作用,楊梅黃酮可能通過抗氧化作用阻止生殖細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化,進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用,保護(hù)活性氧引起的生殖細(xì)胞氧化損傷。

綜上所述,楊梅黃酮通過抗氧化及抗炎作用而對環(huán)磷酰胺所致的小鼠生精損傷發(fā)揮保護(hù)作用,其在臨床開發(fā)對CTX 化療引起生精障礙具有防治作用的藥物具有一定的理論依據(jù),但有關(guān)楊梅黃酮保護(hù)生殖功能的具體細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理還需進(jìn)一步探討。