王 蕓 ,李春曉 ,孫向婉 ,王 鑫 ,趙正午 ,王月明 ,韋東來,劉曉曄,穆 祥,董 虹

[1.北京農學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室,北京昌平102206 ;2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀100193]

嗜中性粒細胞[1](PMNs)是多形核白細胞的一種,在骨髓中形成待發(fā)育成熟后進入血液循環(huán),是機體的固有免疫細胞,參與機體的免疫反應和增強機體的防御作用,其在抵御病原體,控制炎癥發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。目前動物細菌性疾病是畜牧業(yè)的難點,許多研究表明,PMNs 在細菌引起的一些的免疫反應及炎癥等中扮演了重要的角色。近年來對PMNs 的研究越來越多,隨著研究的不斷深入,提取較純的PMNs 成為試驗的關鍵步驟。在大多數(shù)肉食性動物中,PMNs 占血液白細胞總數(shù)的60%～75%,而在牛、綿羊及實驗用動物(如大鼠)中僅占20%～30%[1]。以往的研究中分離的大多是人、狗、兔血液中的PMNs,由于這些動物白細胞中的PMNs 比率較大,因此以常規(guī)方法分離后,即可獲得較高純度的PMNs。但基礎研究中,大鼠是較為常用的實驗動物,而大鼠白細胞中的PMNs 比率較低,甚至不到人血的一半,用常規(guī)方法提取PMNs 的方法分離大鼠PMNs 獲得率較低。

目前從大鼠外周血中分離PMNs 的方法并不成熟,仍以密度梯度離心法為主,主要是利用一種密度介于PMNs 與其他細胞之間而近于等滲的溶液(分層液)做密度梯度離心,使一定密度的細胞按相應密度梯度分布,從而將PMNs 從外周血中加以分離[2]。其中常用的分層液為Percoll,因為Percoll 擴散常數(shù)低,所形成的梯度十分穩(wěn)定,此外,Percoll 不穿透生物膜,對細胞無毒害,還可將受損的細胞及其碎片與完好的活細胞分離,因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒[3-5]。雖然Percoll 密度梯度離心法能提取出PMNs,但獲得的PMNs 純度卻不高,存在較多雜細胞,也有人利用免疫方法如流式分選或者免疫磁珠法進行純化,但成本較高且費時[6]。因此,本試驗在常規(guī)Percoll 密度梯度提取方法[7-10]的基礎上進行改良,以期獲得數(shù)量較多、純度較高、活性較好的PMNs,為后期試驗研究提供細胞材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠10 只,雄性,體重200～300 g,由中國人民解放軍軍事科學院實驗動物中心提供[SPF 級,動物合格證號:SCXK(軍)2012-0004]。

1.2 儀器與試劑 超凈工作臺(哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司,型號:DL-CF-IND) ;CO2培養(yǎng)箱(SANYO,型號:MC0217AC);細胞計數(shù)板(浙江玉環(huán)求精醫(yī)用儀器,批號:XB-K-25)。

Dextran T-500(批號:17032001)購自Pharmacia公司;Percoll(批號:170891-01)購自GE Healthcare公司;PE Mouse Anti-Rat CD11b/c(批號:E15919-105)和APC Mouse Anti-Rat CD172a(批號:E24465-101)購自BD 公司;RPMI-1640(批號:11875-093)和FBS(批號:1616964)購自Gibco 公司;1 × PBS(批號:P1020)、紅細胞裂解液(批號:R1010-100)、大鼠外周血淋巴細胞分離液(批號:P8360),均購自Solarbio 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 常規(guī)方法對PMNs 的提取[10]SD 大鼠心臟采血20 mL 左右,將血液與4% Dextran-T500/PBS 4:1 混合,4 ℃靜置60 min。取上層白細胞懸液,將白細胞懸液以等體積輕鋪在兩層Percoll 界面上(Percoll 柱:2 mL 75% Percoll +2 mL 45% Percoll),水平轉子700 g 室溫下離心45 min。用巴氏吸管吸取兩層percoll 中間的細胞層,并將其與PBS等體積混合,450 g 室溫下離心10 min(若沉淀有紅細胞,則用紅細胞裂解液將殘余的紅細胞除去)。離心后得到的沉淀即為PMNs,將提取出的PMNs 于10% RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少15 min。

1.3.2 優(yōu)化改良后方法對PMNs 的提取 白細胞懸液制備方法同1.3.1,預先將大鼠外周血淋巴細胞分離液加在試管底部,再緩慢加入白細胞懸液,水平轉子700 g 室溫離心25 min,棄上清后加入AKC 緩沖液5 mL 并輕輕吹勻,400 g 室溫離心5 min。向離心得到的沉淀中加入分離液(含2%FBS 的RPMI 1640)5 mL,洗2 遍,400 g 室溫離心5 min。用6 mL 45% Percoll 輕輕重懸細胞,然后加入預先準備好的81%和62% Percoll 柱(3 mL 81%Percoll+4.5 mL 62%Percoll)中離心。1 500 g 4 ℃離心30 min。取大概在3～5 mL 處的云霧狀細胞2 mL,加入5 mL 分離液,1 200 g 4 ℃離心5 min。用含10% FBS 的RPMI 1640 重懸提取出的PMNs,培養(yǎng)至少15 min。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 PMNs 細胞數(shù)量檢測 從分離得到的PMNs混懸液中取出50 μL,用血細胞計數(shù)板于顯微鏡下計數(shù)分離后PMNs 數(shù)量[11-12]。

1.4.2 PMNs 細胞活力檢測 取10 μL 分離得到的PMNs 混懸液進行臺盼藍染色鏡檢[11-12]。計數(shù)所有細胞的總數(shù),統(tǒng)計其中的活細胞和死細胞數(shù)目,按公式計算出PMNs 活力。PMNs 活力(%)=(活細胞數(shù)/觀察的細胞總數(shù)) ×100%。

1.4.3 PMNs 細胞純度檢測 (1)姬姆薩染色:從分離得到的PMNs 混懸液中取出50 μL 推片進行姬姆薩染色鏡檢,顯微鏡下隨機計數(shù)100 個細胞,計算分離得到的嗜中性粒細胞的純度百分比。PMNs 純度(%)=(PMNs 計數(shù)/100) ×100%。(2)流式細胞儀檢測:將待測細胞用PBS 制成細胞懸液,132 g 4 ℃離心5 min,棄上清,加入PE Mouse Anti-Rat CD11b/c 或APC Mouse Anti-Rat CD172a 抗體4 ℃孵育30 min。離心后PBS 洗2 遍,用200 μL PBS 重懸后立即上機檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗結果用Graphpad Prism 6 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。?P<0.05、??P<0.01 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PMNs 細胞數(shù)量檢測 由圖1 可知,改良后方法提取的PMNs 數(shù)量與常規(guī)方法相比差異顯著(P<0.05),說明改良后的方法得到的PMNs 數(shù)量較多。

圖1 PMNs 數(shù)量比較

2.2.2 PMNs 細胞活力檢測 提取出的細胞經(jīng)臺盼藍染色后,死亡的細胞著色淺藍色并膨大,無光澤,活細胞不著色并保持正常形態(tài),有光澤。經(jīng)統(tǒng)計,兩組細胞活性均較高無明顯差異,均可達97%以上。見圖2。

圖2 PMNs 臺盼藍染色

2.3 PMNs 細胞純度檢測

2.3.1 姬姆薩染色 PMNs 鏡下可見胞漿呈淡粉色,著色均勻,核呈深紫紅色,一般可分2～5 葉,以3 葉為多。由封三彩版圖3 可知,改良后方法(封三彩版圖3B)提取出的大部分為PMNs,常規(guī)方法(封三彩版圖3A)提取出的大部分為淋巴細胞,PMNs較少。經(jīng)統(tǒng)計后,發(fā)現(xiàn)常規(guī)方法提取的PMNs 純度約為20%,改良后提取的PMNs 純度約為80%,說明改良后的方法提取PMNs 純度較高。

2.3.2 流式細胞儀檢測 通過流式細胞儀檢測后發(fā)現(xiàn)提取出的細胞具有CD11b/c+(見封三彩版圖4B)、CD172a+表型(見封三彩版圖4C),可鑒定其為PMNs[13]。由圖4 可知,改良后提取的PMNs 純度能達到80%,而常規(guī)方法提取的PMNs 純度只有20%,改良后方法提取的PMNs 純度與常規(guī)方法相比差異極顯著(P<0.01),此結果說明改良后的方法提取PMNs 純度遠高于常規(guī)方法。

圖3 PMNs 姬姆薩染色 (×1 000)

圖4 PMNs 純度鑒定

3 討論

PMNs 在抗菌和抗炎方面的特點使其成為國內外的研究熱點,目前國內外文獻[14-18]顯示,分離嗜中性粒細胞的方法眾多,除了本文用到的Percoll 密度梯度離心法外,還有Ficoll 方法、Dextran 作用下紅細胞自然沉降法、裂解紅細胞法、流式細胞儀法、免疫磁珠等方法[19-21]。Haslett 等[22]發(fā)現(xiàn)Ficoll 法對PMNs 形態(tài)、趨化能力,PMNs 功能等有較大影響,而Dextran 作用下紅細胞自然沉降法和裂解紅細胞法PMNs 獲得率較低[20,23],流式細胞儀法和免疫磁珠法操作步驟復雜且成本較高,不易推廣[6],因此本試驗選擇了應用較多的Percoll 密度梯度離心法[5],并在此基礎上進行優(yōu)化改良。

本試驗考察了優(yōu)化后提取方法對PMNs 純度、活力和數(shù)量的影響,結果表明改良后方法和常規(guī)方法相比純度從20%提高到了80%,約為常規(guī)方法的4 倍,數(shù)量從6.8 ×106個提高到了8.3 ×106個,約為常規(guī)方法的1.2 倍,且優(yōu)化后的方法細胞活性仍然較高,達到98.33%。目前報道的文獻[19-21]中所采取的從大鼠外周血中分離PMNs 的方法多因含有較多的淋巴細胞和單核細胞而導致其純度不高,因此本試驗通過加入外周血淋巴細胞分離液以去除大部分的淋巴細胞。此外有文獻[24]表明即使只有0.003 g/mL 的Percoll 梯度密度變化都會對細胞群的純度產(chǎn)生顯著的影響,因此本試驗對Percoll 密度進行優(yōu)化從而提高PMNs 純度。常規(guī)方法所用的Percoll 大多為45% 和75%,相對應的密度為1.058 g/mL 和1.090 g/mL,改良后方法所用的3 層Percoll 分別為45%、62%和81%,相對應的密度分別為1.058 g/mL、1.078 g/mL 和1.100 g/mL。而大鼠外周血PMNs 密度為1.085～1.097 g/mL,淋巴細胞密度為1.052～1.077 g/mL,單核細胞密度為1.050～1.066 g/mL[25]。若采用45%和75% Percoll進行分離,兩層Percoll 中間的細胞即為PMNs,但同時淋巴細胞和單核細胞也會出現(xiàn)在2 層Percoll 中間,從而造成雜細胞過多,此外還會損失掉一部分密度為1.091～1.097 g/mL 的PMNs,致使最終提取出的PMNs 質量不高。改良后的提取方法采用3 層Percoll 很好的解決了這個問題,淋巴細胞和單核細胞出現(xiàn)在45% 和62% Percoll 之間,PMNs 則出現(xiàn)在62%和81%Percoll 之間,此方法能將淋巴細胞和單核細胞盡可能的去除掉,并能最大限度的保留PMNs。

除本試驗中采取的常規(guī)方法外,本實驗室前期還嘗試過商品化的試劑盒但效果并不理想,得到的PMNs 純度不到20%,同時根據(jù)文獻報道[17]摸索過其他濃度的Percoll 及相應條件,發(fā)現(xiàn)PMNs 純度均在80%左右,數(shù)量在6.0 ×106個左右,但由于其轉速過高或時間過長反而會對PMNs 造成機械性損傷對其研究及應用存在一定影響,這些結果與文獻[1]報道的現(xiàn)象一致。改良后方法可一次分離純化并得到數(shù)量較多的PMNs,但操作時要注意溫度和Percoll 柱等問題。PMNs 活性和溫度[26]有密切關系,在分離過程中當某些步驟的溫度超過室溫時,PMNs 活性會降低,得到的細胞數(shù)量也偏低,有些重要的步驟必須在4 ℃的低溫環(huán)境下進行。此外需要特別注意在制備Percoll 層時要求保護好界面,向里加入液體時也需要十分小心,動作要輕緩,一定不能破壞其分層,否則將達不到目的。

總之,本試驗改進后的方法在保證了PMNs 活力的基礎上提高了其純度和數(shù)量,表明優(yōu)化改良后方法分離PMNs 純度好,數(shù)量多,且經(jīng)濟、簡便,是一種簡單、高效的較為理想的PMNs 分離方法,適于臨床和科研中廣泛應用,為PMNs 生物學特性及其功能的研究奠定了基礎。