施江敏 ,黃圓圓 ,朱慧敏 ,吳雨佳 ,劉 洋 ,呂士杰 ,高俊濤

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,吉林吉林132013 ;2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,吉林延吉133002 ;3.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013)

近年來,在全球變暖的大背景下,我國乃至全球極端天氣頻發(fā),多地出現(xiàn)大范圍熱浪襲擊[1]。高溫環(huán)境造成心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等的非特異性損傷[2],增加多種疾病的發(fā)病率和病死率,已成為危害人體健康的重要危險因素[3],但高溫環(huán)境對神經(jīng)系統(tǒng)尤其是學(xué)習(xí)記憶能力方面研究較少。有研究表明,高溫環(huán)境對人體注意力[4],記憶力[5]和信息處理能力[6]等方面產(chǎn)生不利影響,因此,研究熱應(yīng)激預(yù)處理對學(xué)習(xí)記憶功能的保護(hù)作用及其機(jī)制是很有必要的。本試驗從行為學(xué)及分子水平出發(fā),觀察高溫暴露后大鼠海馬區(qū)炎癥因子分泌的變化,探討神經(jīng)炎癥是否參與高溫?fù)p傷學(xué)習(xí)記憶功能的調(diào)控,旨在為高溫?fù)p傷大腦認(rèn)知功能提供新的理論依據(jù),同時為抗高溫機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar 大鼠(遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司)45 只,雄性,體重(180 ±20)g,動物許可證號:SCXK(遼)2015-0001。動物試驗經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行(批準(zhǔn)號:20150316)。

1.2 儀器與試劑 DKB-501S 型超級恒溫水浴(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),550 型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司),RMT-100 型八臂迷宮視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),OFT-100 型開場活動實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),白介素-1β ELISA 檢測試劑盒(批號:20170618)、腫瘤壞死因子-αELISA 檢測試劑盒(批號:20170618)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶檢測試劑盒(批號:20170622)和總一氧化氮合酶檢測試劑盒(批號:20170622),均購自美國Minneapolis 公司。

1.3 動物分組與處理 將45 只Wistar 大鼠隨機(jī)分成正常對照組,熱應(yīng)激模型組和熱應(yīng)激預(yù)處理組。使用超級恒溫水浴,連接自制有機(jī)玻璃夾層水循環(huán)艙,保持室溫23～24 ℃,熱循環(huán)艙溫度42 ℃,相對濕度40%～60%,風(fēng)速0～0.2 m/s,穩(wěn)定1 h 以上。正常對照組置于室溫(24 ℃)環(huán)境中;熱應(yīng)激模型組置于42 ℃熱艙中30 min;熱應(yīng)激預(yù)處理組置于42 ℃熱艙中,預(yù)處理10 min/d,連續(xù)15 d,然后置于42 ℃熱艙中30 min。

1.4 學(xué)習(xí)記憶功能檢測

1.4.1 八臂迷宮試驗 大鼠每日空腹12 h。第1 -2 天,迷宮各臂及中央?yún)^(qū)分撒著食物顆粒(每臂1粒,直徑約4～5 mm),每次將1 只大鼠置于迷宮中央(通往各臂的門打開),讓其自由攝食、探究10 min。第3 天開始訓(xùn)練,在1,2,4,7 臂內(nèi)放置食物顆粒,每次將1 只大鼠置于迷宮中,由其自由選擇進(jìn)入放射狀臂覓食,直至10 min 末或提前完成所有臂的覓食,即結(jié)束一次訓(xùn)練。測試指標(biāo):(1)潛伏期,即大鼠吃完所有食粒所花的時間;(2)工作記憶錯誤,即在同一次訓(xùn)練中大鼠再次進(jìn)入已經(jīng)吃過食粒的臂的次數(shù);(3)參考記憶錯誤,即動物進(jìn)入不曾放過食粒的臂的次數(shù);(4)總錯誤次數(shù),即工作記憶錯誤和參考記憶錯誤總和。連續(xù)5 次訓(xùn)練的工作記憶錯誤為0、參考記憶錯誤不超過1 次時,表明訓(xùn)練成功。

1.4.2 曠場試驗 試驗箱底部畫有9 個虛擬的、等大的正方格,包括沿側(cè)壁的外周格(8 個)和中間的中央格(1 個)。試驗開始時,操作者將大鼠放在正中央?yún)^(qū),系統(tǒng)開始同步自動記錄大鼠5 min 內(nèi)在實驗箱里的活動。測試指標(biāo):(1)水平運(yùn)動,即某一肢體越過的水平格子數(shù);(2)垂直運(yùn)動,即后肢站立次數(shù)。

1.5 炎癥因子檢測 取每組大鼠海馬組織,采用相關(guān)試劑盒測定白介素1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNFα)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)和總一氧化氮合酶(Total nitric oxide synthase,tNOS)含量,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5 軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以()表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 八臂迷宮潛伏期和工作記憶錯誤次數(shù) 與正常對照組比較,熱應(yīng)激模型組潛伏期和工作記憶錯誤次數(shù)明顯升高(P<0.05);與熱應(yīng)激模型組比較,熱應(yīng)激預(yù)處理組潛伏期和工作記憶錯誤次數(shù)明顯降低(P<0.05)?？梢姼邷?fù)p傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低,熱應(yīng)激預(yù)處理能夠降低損傷程度(見表1)。

表1 各組大鼠八臂迷宮潛伏期、工作記憶錯誤次數(shù)比較(,n=15)

表1 各組大鼠八臂迷宮潛伏期、工作記憶錯誤次數(shù)比較(,n=15)

與正常對照組比較,?: P<0.05,??: P<0.01; 與熱應(yīng)激模型組比較,#: P<0.05,##:P<0.01;下表同

2.2 八臂迷宮參考記憶錯誤次數(shù)和總錯誤次數(shù)與正常對照組比較,熱應(yīng)激模型組參考記憶錯誤次數(shù)和總錯誤次數(shù)明顯升高(P<0.05);與熱應(yīng)激模型組比較,熱應(yīng)激預(yù)處理組參考記憶錯誤次數(shù)和總錯誤次數(shù)明顯降低(P<0.05)。可見高溫?fù)p傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低,熱應(yīng)激預(yù)處理能夠降低損傷程度(見表2)。

表2 各組大鼠八臂迷宮參考記憶錯誤次數(shù)、總錯誤次數(shù)比較(,n=15)

表2 各組大鼠八臂迷宮參考記憶錯誤次數(shù)、總錯誤次數(shù)比較(,n=15)

2.3 曠場試驗 熱應(yīng)激模型組、熱應(yīng)激預(yù)處理組、正常對照組水平運(yùn)動得分、垂直運(yùn)動得分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠曠場試驗水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動得分比較(,n=15)

表3 各組大鼠曠場試驗水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動得分比較(,n=15)

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果 與正常對照組比較,熱應(yīng)激模型組大鼠海馬組織中IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)、iNOS(P<0.01)和tNOS(P<0.05)水平顯著升高;與熱應(yīng)激模型組比較,熱應(yīng)激預(yù)處理組大鼠海馬組織中IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)、iNOS(P<0.05))水平顯著降低。說明高溫導(dǎo)致炎癥因子的升高,熱應(yīng)激預(yù)處理能夠減輕海馬組織炎癥反應(yīng)(見表4)。

表4 各組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、iNOS、tNOS 含量比較(,n=15)

表4 各組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、iNOS、tNOS 含量比較(,n=15)

3 討論

學(xué)習(xí)記憶功能是大腦重要的高級神經(jīng)功能之一,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的整合。大量研究涉及與熱應(yīng)激有關(guān)的生理反應(yīng),但熱應(yīng)激對學(xué)習(xí)記憶功能的影響仍存在爭議。不同的試驗方法難以確定熱本身導(dǎo)致認(rèn)知缺陷以及熱與認(rèn)知的關(guān)系[7]。八臂迷宮可以有效地反映大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能[8],試驗中熱應(yīng)激模型組潛伏期、工作記憶錯誤、參考記憶錯誤、總錯誤次數(shù)均明顯高于正常對照組,表明熱應(yīng)激模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降,這與其他研究結(jié)果及臨床觀察相一致[9-10]。熱應(yīng)激模型組潛伏期10 d 后才明顯上升,說明熱應(yīng)激損害學(xué)習(xí)記憶能力并沒有立刻發(fā)生,這與Morley J 認(rèn)為高溫環(huán)境引起的學(xué)習(xí)記憶改變不會在高熱暴露后立即產(chǎn)生的結(jié)果一致[11],而高溫環(huán)境引起的其他認(rèn)知功能(如注意力,反應(yīng)時間等)受損發(fā)生于體溫升高后的1 -2 h[11-12],熱應(yīng)激預(yù)處理能夠延緩這一過程。工作記憶錯誤反映了大鼠短時記憶損傷程度,試驗表明,熱應(yīng)激對大鼠短時記憶產(chǎn)生影響。參考記憶錯誤反映了大鼠長時記憶損害程度,熱應(yīng)激模型組的長時記憶損傷嚴(yán)重程度不僅體現(xiàn)在損傷速度,而且體現(xiàn)在損傷程度上,隨著暴露時間的增加,長時記憶損傷程度加重,而熱應(yīng)激預(yù)處理能夠延緩損傷的發(fā)生并減輕損傷程度。熱應(yīng)激導(dǎo)致全身性炎性反應(yīng)[13-14]:熱應(yīng)激導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α在血液中的含量增加[15]。持續(xù)的熱應(yīng)激使機(jī)體誘導(dǎo)免疫反應(yīng),機(jī)體白細(xì)胞、血小板含量增加[16],誘導(dǎo)導(dǎo)核因子NF-κB 活化[17],激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并使其釋放炎性分子和細(xì)胞毒性因子,如環(huán)氧酶-2(COX-2)、iNOS 衍生物,TNF-α,IL-1β 等[18],進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元和突觸損傷,TNF-α 和IL-1β 抑制成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和認(rèn)知功能[19]。神經(jīng)炎癥因子上調(diào)所致學(xué)習(xí)記憶功能的降低越來越引起人們的關(guān)注,是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的一個重要機(jī)制。高溫環(huán)境可顯著增加海馬炎癥反應(yīng)[17],導(dǎo)致記憶障礙,與本試驗結(jié)果相一致。本試驗研究發(fā)現(xiàn),高溫環(huán)境后大鼠海馬組織內(nèi)的炎癥因子含量也升高,可見高溫環(huán)境介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與學(xué)習(xí)記憶下降的神經(jīng)調(diào)控過程。熱應(yīng)激預(yù)處理通過減輕炎癥反應(yīng)降低高溫?zé)釕?yīng)激對學(xué)習(xí)記憶功能的損傷作用,這種保護(hù)作用與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。大鼠曠場試驗是一種經(jīng)典地反映在大鼠在新環(huán)境中的探究行為及情緒反應(yīng)的動物試驗方法,水平運(yùn)動得分情況能反應(yīng)大鼠的自主活動性,垂直運(yùn)動得分情況可反應(yīng)大鼠對新鮮環(huán)境的好奇度,本試驗中,熱應(yīng)激模型組大鼠的水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)差異,表明本試驗條件下熱應(yīng)激沒有改變大鼠的自主活動,此結(jié)果與Minho Moon 等人的試驗結(jié)果一致[20]。曠場試驗表明,本試驗中熱應(yīng)激引起的學(xué)習(xí)記憶能力改變,并非由自主活動行為改變引起。綜上所述,長期高溫暴露可損傷大鼠的認(rèn)知功能尤其是學(xué)習(xí)記憶能力障礙,并且隨著暴露時間的增加而加重,長期高溫暴露引起學(xué)習(xí)記憶功能損傷可能與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血腦屏障通透性增高和腦缺血等有關(guān),熱應(yīng)激預(yù)處理通過減輕炎癥反應(yīng)延緩學(xué)習(xí)記憶功能降低進(jìn)程,減輕損傷程度,相關(guān)的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。