郭淞寧 ,張冬星 ,田佳鑫 ,張海月 ,康元環(huán) ,單曉楓 ,錢愛東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春130118 ;2.吉林省敦化市畜牧業(yè)管理局,吉林敦化 133700)

鯉魚(Cyprinus carpio)營養(yǎng)豐富,養(yǎng)殖區(qū)域廣泛,但是集體化養(yǎng)殖,導(dǎo)致疾病時(shí)有發(fā)生,因此預(yù)防疾病發(fā)生的魚用疫苗備受關(guān)注。與傳統(tǒng)疫苗相比,核酸(DNA)疫苗可同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫,更安全、更利于生產(chǎn),但其蛋白表達(dá)量過低,無法刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答,限制了其自身的發(fā)展速度。為改善這一缺陷,研究者們利用核酸疫苗可將多種基因聯(lián)合在一起制成基因聯(lián)合疫苗的特點(diǎn),研發(fā)出核酸疫苗分子佐劑如干擾素、補(bǔ)體分子及白介素等來提高核酸疫苗免疫效果[1]。補(bǔ)體成分C5(Completement5)對于補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)及清除入侵病原過程中起到重大作用[2],而且近年來已有C5 作為分子佐劑作用在哺乳動物上的報(bào)道[3-4],但目前關(guān)于魚的研究較少,Kato Y[5]已從鯉魚肝臟中擴(kuò)增出6 種不同C5 樣基因片段,其中2 種呈發(fā)散型(I 型和II 型)。因此本試驗(yàn)克隆了C5-I 基因,利用IPTG 對其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,使之達(dá)到蛋白表達(dá)的最大效率并對其免疫原性進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究魚類補(bǔ)體的生物學(xué)功能及魚類核酸疫苗提供科學(xué)依據(jù),且為C5-I 分子作為佐劑的高效且作用力持久的魚用疫苗提供物質(zhì)保證。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試驗(yàn)動物 大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21(DE3) 菌株、pET-32a(+)Vector 與鼠抗C5-I 血清(抗體效價(jià)為500,應(yīng)用濃度為1 ∶500)均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存;平均體質(zhì)量300 g/ 尾試驗(yàn)用鯉魚,購自長春市某養(yǎng)殖場;小鼠30 只,平均體重25 g 左右,由吉林省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑Ex Taq、XhoI 和BamH I、DL-2 000 DNA Marker、T4 DNA 連接酶、TRIzol 反轉(zhuǎn)錄試劑盒,均購自TaKaRa 公司;HisPur Ni-NTA Spin Columns,購自Thermo 公司;廣譜蛋白Marker、預(yù)染彩虹蛋白Marker,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;RNA 提取試劑盒,購自BioFlux 公司;DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒,購自O(shè)mega 公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG (二抗),購自艾美捷科技有限公司;異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑,均購自Sigma 公司。

1.3 鯉魚C5-I基因的克隆 對鯉魚肝臟RNA 進(jìn)行提取,并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank 中報(bào)道的C5-I基因cDNA 序列(GenBank number:NW_017538213.1)的開放閱讀框架,用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出上、下游引物,在上游引物中設(shè)計(jì)了XhoI酶切位點(diǎn)和6 個組氨酸標(biāo)簽,在下游引物中設(shè)計(jì)BamH I 酶切位點(diǎn)。上游引物P1:5′-CGGGATCC CAAAACCTCTAGCACAGAGGGG-3′(下劃線處為BamHI 酶切位點(diǎn))下游引物P2:5′-CCCTCGAGCTCACTGAATACTCCAACTGCTTTC-3′(下劃線處為XhoI酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃5 min;94 ℃1 min、52 ℃1 min、72 ℃1 min,30 個循環(huán),72 ℃10 min;將擴(kuò)增后的C5-I基因純化回收,并與克隆載體pEASY-Blunt Zero 連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEASY-Blunt Zero-C5-I,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α,培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒測序鑒定。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將測序結(jié)果應(yīng)用BLAST 檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行序列同源性分析,與已知C5-I基因序列進(jìn)行比對。

1.5 目的基因編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用DNASTAR 軟件翻譯出氨基酸序列;應(yīng)用ProtParam預(yù)測編碼產(chǎn)物的基本理化性質(zhì);SingalP v3.0 進(jìn)行信號肽分析;TMHMM v2.0 進(jìn)行跨膜區(qū)分析;目的蛋白二級結(jié)構(gòu)由SSPro 4.0 分析;應(yīng)用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.6 pET32a(+)-C5-I 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將pEASY-Blunt Zero-C5-I 和pET-32a(+) 載體分別用BamH I 和XhoI 雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行目的片段的回收,用T4 DNA 連接酶25 ℃連接3 h,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α,提取重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,挑取陽性克隆子于含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中(100 μg/mL),37 ℃過夜后提取質(zhì)粒。隨后進(jìn)行PCR 鑒定和雙酶切鑒定,將陽性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,測序后的陽性質(zhì)粒命名為pET32a(+)-C5-I。

1.7 pET-32a(+)-C5-I 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 參照牛金中[6],張雪利[7]等方法并稍作改進(jìn),取重組質(zhì)粒pET32a(+)-C5-I 接種到含Amp 的LB 培養(yǎng)液管,37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6 左右時(shí),取1 mL作為未誘導(dǎo)對照,其余加入IPTG 使菌液終濃度分別為:0.0、0.1、0.4、0.8、1.0、1.5 mmol/L,37℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h 來確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳濃度;以相同方法,加入IPTG 使其終濃度為1.0 mmol/L 時(shí)37℃繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6、8、15、20 h 和24 h 來確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間;加入IPTG 使其終濃度為1.0 mmol/L 后將菌液分別置20 ℃、25 ℃、30 ℃和37 ℃轉(zhuǎn)速為120 r/min 搖床中誘導(dǎo)8 h,以確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度。

1.8 目的蛋白的純化和鑒定 為檢測目的蛋白的表達(dá)形式,將誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎,并對蛋白溶液進(jìn)行Ni2+柱親和層析純化并進(jìn)行SDS-PAGE 檢測,隨后對純化蛋白進(jìn)行梯度復(fù)性,將收集到的洗脫液加到經(jīng)預(yù)處理的透析袋中依次放入不同濃度尿素的透析袋10 h,其濃度依次為0、2、4 mol/L 和6 mol/L,復(fù)性后采用BCA 法測定蛋白質(zhì)量濃度。

1.9 多克隆抗體的制備 經(jīng)純化的目的蛋白與弗氏完全佐劑以1 ∶1比例混勻形成乳化狀態(tài)后,采用皮下注射法對小鼠進(jìn)行免疫,劑量為200 μL/只;3 次免疫間隔周期為14 d,在二免時(shí)采用弗氏不完全佐劑與純化目的蛋白進(jìn)行1 ∶1混合,三免結(jié)束后的第14 天進(jìn)行小鼠眼眶采血,采集的血液先在37 ℃靜置1 h,再4 ℃過夜處理之后5 000 r/ min 離心10 min,獲得血清。

1.10 Western Blot 分析純化的C5-I 基因蛋白 將純化好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,在5%脫脂奶粉中4 ℃封閉8 h 后,加入經(jīng)TBST 1 ∶500 稀釋的免疫血清,4 ℃孵育12 h,TBST 洗滌3 次,每次5 min。加入經(jīng)TBST 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗(1 ∶2 000 稀釋),4 ℃孵育2 h 后,TBST 洗膜3 次,每次5 min,ECL 顯色分析蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1C5-I基因的克隆 通過提取鯉魚肝臟總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)物約為450 bp(圖1),經(jīng)測序全長為469 bp,包含鯉魚C5-I基因完整的基因序列。

圖1 C5-I 目的片段PCR 擴(kuò)增

2.2C5-I基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 根據(jù)鯉魚C5-I基因核苷酸序列與GenBank 已報(bào)道的C5-I基因序列進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn),目的蛋白與鯽魚C5-II 屬同一分支,同源性99%(圖2)。

圖2 C5-I 基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

2.3 C5-I 蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì) 對C5-I 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,C5-I 蛋白的氨基酸數(shù)目為156 個,原子組成為C1717H2553N439O531S2,分子量:17807.44,理論等電點(diǎn)為PI:8.49,不穩(wěn)定指數(shù)計(jì)算為54.49。

2.3.2 疏水性分析 對C5-I 蛋白的疏水性分析可知,C5-I 蛋白大約在第70～80 位氨基酸之間有一個典型的疏水性區(qū)域,在80～100 之間有一個明顯的親水區(qū)(圖3)。

圖3 C5-I 蛋白的疏水性分析

圖4 C5-I 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.3 編碼蛋白的信號肽與跨膜區(qū)分析 對C5-I蛋白基因編碼蛋白的信號肽進(jìn)行分析,S 平均值(mean S-score) <0.5,該蛋白無信號肽,對C5-I 蛋白基因編碼蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示,C5-I 無跨膜螺旋區(qū)域。

2.3.4 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 對C5-I 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。其結(jié)果表明:C5-I 蛋白的二級結(jié)構(gòu)組分中,α 螺旋(H)占29.1%,β 折疊(E)占14.8%,無規(guī)則卷曲(C)占56.1%。

2.3.5 C5-I 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 對C5-I 三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(圖4),結(jié)果表明:C5-I 蛋白與已報(bào)道的補(bǔ)體C5 的同源性最高,為38.41%。

2.4 原核表達(dá)載體pET32a(+)-C5-I 的構(gòu)建與鑒定 如圖5 所示,重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增與XhoI、BamH I 雙酶切后分別得到大小約為469 bp 和5 900 bp 的片段,與預(yù)期結(jié)果一致(圖5),測序結(jié)果顯示與pET32a 連接正確,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)-C5-I。

圖5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖6 pET32a(+)-C5-I SDS-PAGE 檢測

2.5C5-I基因在BL21 中的原核表達(dá) 如圖6 所示,測序正確的pET32a(+)-C5-I 菌株經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后,通過SDS-PAGE 電泳檢測到約22 kDa 的蛋白條帶,其大小與預(yù)期一致。

2.6 pET-32a(+)-C5-I 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 對不同濃度IPTG 誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果(圖7)由SDSPAGE 顯示,重組菌體和未誘導(dǎo)菌均在蛋白Marker 22 kDa 附近出現(xiàn)蛋白條帶,表明pET32a(+)-C5-I目的蛋白成功在大腸桿菌BL21 中表達(dá),其IPTG 誘導(dǎo)濃度為0.4 mmol/L 。對誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果(圖8)顯示,6 h 誘導(dǎo)的表達(dá)效果比其他時(shí)間更佳。對誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)SDS-PAGE 分析結(jié)果如圖9 所示,37 ℃蛋白表達(dá)量最高,所以在37 ℃,IPTG 終濃度為0.4 mmol/L,誘導(dǎo)6 h,C5-I 目的蛋白表達(dá)效率最高。

圖7 pET32a(+)-C5-I 不同IPTG 濃度誘導(dǎo)

圖8 pET32a(+)-C5-1 不同時(shí)間誘導(dǎo)

圖9 pET32a(+)-C5-I 不同溫度誘導(dǎo)

2.7 C5-I 蛋白的表達(dá)鑒定 取最佳誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)的重組菌液,經(jīng)鎳柱純化后的目的蛋白通過SDSPAGE 檢測獲得約22 kDa 的蛋白條帶,與預(yù)期大小一致(圖10),取純化后蛋白經(jīng)Western Blot 檢測顯示,在22 kDa 處出現(xiàn)目的蛋白印記(圖11),表明C5-I 蛋白具有免疫原性。

圖10 pET32a(+)-C5-I 融合蛋白純化的SDS-PAGE 分析

圖11 C5-I 蛋白的Western Bolt 分析

3 討論

目前魚養(yǎng)殖業(yè)養(yǎng)殖密度較大導(dǎo)致病原菌在水環(huán)境及水生動物間傳播迅猛,魚用疫苗得到廣泛關(guān)注,傳統(tǒng)疫苗在劑量較低的情況下其免疫保護(hù)作用不明顯,新型疫苗中核酸疫苗因其可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答且安全、易于生產(chǎn),具有很好的應(yīng)用前景[8]。但是核酸疫苗存在抗體產(chǎn)生慢、水平低的缺點(diǎn),需要應(yīng)用佐劑進(jìn)行克服,而補(bǔ)體具有增強(qiáng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的作用,因此,將其作為分子佐劑應(yīng)具有一定功效[9]。補(bǔ)體C5 在炎癥反應(yīng)和補(bǔ)體化細(xì)胞溶解中起重要作用,Chiung-Yu Hung[4]表明,將補(bǔ)體C5a 作為分子佐劑可刺激宿主T 細(xì)胞增殖進(jìn)而產(chǎn)生更多的T 淋巴細(xì)胞,激起更強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng);徐金梅[10]以C5a 作為分子佐劑與抗原相連免疫斑馬魚,結(jié)果顯示,作為佐劑不僅可以優(yōu)先激活固有免疫,還能促進(jìn)疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答,但將C5-I 作為分子佐劑的研究尚少,其是否可作為保護(hù)性抗原應(yīng)用于疫苗有待于進(jìn)一步研究。

鑒于此,本試驗(yàn)克隆出鯉魚補(bǔ)體C5-I基因,通過比對發(fā)現(xiàn),鯉魚C5-I 與鯉魚C5-II 屬同一分支,其同源性達(dá)到99%,但之間可能存在功能差異。C5-I蛋白分子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,在第70～80 位氨基酸之間有一個典型的疏水性區(qū)域位,在80～100 位氨基酸之間有一個親水性區(qū)域,有研究顯示[5]C5-I基因由高度同源的多基因編碼,可抑制炎癥反應(yīng)。誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果與魏世娜等[11]對紅笛鯛NCCRP-1基因研究相似,本試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-C5-I 經(jīng)條件優(yōu)化后發(fā)現(xiàn),在37 ℃、0.4 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)6 h 條件下,重組蛋白表達(dá)量達(dá)到最高,楊林[13]等報(bào)道表明,IPTG 的適宜濃度范圍為0.1～1.0 mmol/L,經(jīng)HisPur Ni-NTA Spin Columns純化后的蛋白分子量與預(yù)期大小一致;Western Blot分析顯示,該目的蛋白可與鼠抗C5-I 蛋白多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,說明C5-I 蛋白具有良好的免疫原性,為研究補(bǔ)體作為分子佐劑的工程亞單位疫苗提供基礎(chǔ)。