龐洪澤 ,張召興,2 ,張海龍 ,李佩國 ,李蘊(yùn)玉 ,賈青輝 ,張香齋

(1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北秦皇島066604 ;2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,河北承德 067000)

奇異變形桿菌屬于腸桿菌科變形桿菌屬中的兼性厭氧革蘭陰性桿菌,該菌具有菌毛和鞭毛結(jié)構(gòu),具有運(yùn)動性,不形成莢膜和芽孢,主要分布污水、土壤、糞便及動物的體內(nèi)[1-2]。奇異變形桿菌可以感染雞、豬、山羊、奶牛等多種動物及人,是臨床中一種常見的條件性致病菌[3-4]。雞奇異變形桿菌病是由致病性奇異變形桿菌引起不同日齡雞的一種急性傳染性疾病,主要臨床特征為敗血癥、水樣腹瀉、一側(cè)或兩側(cè)腿麻痹,主要危害7 周齡以下的雛雞,其發(fā)病率和死亡率較高,而愈后的雛雞生長緩慢,給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。

2017 年10 月,秦皇島地區(qū)某雞場,9 日齡的雛雞發(fā)病,病雞精神不振,體溫升高,排水樣的腹瀉,在腹瀉后的1 至3 天內(nèi)出現(xiàn)死亡。為確定引起雛雞死亡的病原菌,無菌采集病死雛雞病料組織進(jìn)行病原菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn),為該病的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 秦皇島地區(qū)某雞場9 日齡病死的雛雞,無菌采集病死雞肝臟組織。

1.2 主要試劑與設(shè)備普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、革蘭染色液試劑盒,均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;藥敏紙片,購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;生化鑒定試紙條,購自北京中生瑞泰科技有限公司;DL-2 000 Marker、2 ×TaqMarker Mix,均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。梯度PCR 由儀德國eppendorf 公司生產(chǎn);隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科技儀器有限公司;ATB 自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)由法國生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動物 健康9 日齡海蘭褐雛雞10 只,購自秦皇島市金牧種雞場。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 無菌采集病死雛雞肝臟組織劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 -18 h,挑取優(yōu)勢單個(gè)菌落分別接種于S.S.瓊脂平板,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 -18 h。挑取單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng),取純化培養(yǎng)的分離菌株革蘭染色,顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 生化試驗(yàn)鑒定 將純化培養(yǎng)的分離菌株按照說明書接種于腸桿菌科生化鑒定試紙條中,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 -24 h,用ATB 自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化特性鑒定。

1.6 細(xì)菌的16S rRNA PCR 鑒定及測序 參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rRNA 序列,設(shè)計(jì)的通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮方法提取細(xì)菌DNA 組,進(jìn)行PCR 鑒定。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL:2 ×TaqMix 25 μL,上、下游引物各2 μL,DNA 模板3 μL,ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性50 s,57.5 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。取出5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測正確后,將PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定,測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較與分析。

1.7 致病性試驗(yàn) 調(diào)整分離菌株菌液濃度為108CFU/mL,將10 只9 日齡健康雛雞分為2 組,每組5只,試驗(yàn)組每只雛雞腹腔注射0.25 mL(108CFU/mL),對照組每只雛雞給予等量的生理鹽水,攻毒12 h 后,觀察7 d,記錄每組的發(fā)病情況和死亡情況。

1.8 藥敏試驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B 紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 分離菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長出圓形、扁平的、半透明或者透明的菌落,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,菌落的邊緣有遷徙生長現(xiàn)象;在S.S.瓊脂培養(yǎng)基上生長出圓形、光滑、邊緣整齊、中心帶有黑心的無色透明的菌落;革蘭染色鏡檢顯示,分離菌株為革蘭陰性菌,兩端鈍圓桿狀菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果 分離菌株可發(fā)酵半乳糖、葡萄糖、木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,甲基紅試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、過氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、尿素酶陽性;吲哚試驗(yàn)、氧化酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水酶為陰性;產(chǎn)生H2S。用ATB 自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定為奇異變形桿菌,評定結(jié)果合格率為99.9%。

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組雛雞接種12 -24 h后,雛雞出現(xiàn)不同程度的死亡,至72 h 雛雞全部死亡。在死亡雛雞肝臟中分離到奇異變形桿菌,對照組的雛雞健康存活,從而證實(shí)所分離的奇異變形桿菌具有很強(qiáng)的致病性。

2.4 細(xì)菌的16S rRNA PCR 鑒定結(jié)果 用16S rRNA 的通用引物對分離菌株進(jìn)行PCR 檢測,擴(kuò)增出大約為1 500 bp 的目的條帶(圖1),與預(yù)期片段相符合。將測序結(jié)果與GenBank 基因序列數(shù)據(jù)庫中基因序列進(jìn)行比對,與已發(fā)表的奇異變形桿菌的基因序列匹配度高達(dá)99%以上。因此,確定了分離菌株為奇異變形桿菌。

圖1 分離菌株16S rRNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見表1,分離菌株對頭孢曲松、頭孢克肟、環(huán)丙沙星、丁胺卡那霉素、林可霉素5種藥物敏感;對頭孢拉啶、恩諾沙星、新霉素、大觀霉素4 種藥物中敏;對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、氟苯尼考、慶大霉素、多西環(huán)素、多粘菌素7 種藥物耐藥。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

奇異變形桿菌是一種常見的條件性致病菌,廣泛分布于動物和人的體表、黏膜及消化道內(nèi),該菌在動物的消化道可以產(chǎn)生毒素,導(dǎo)致動物中毒,不僅可以感染雞、山羊、奶牛和豬等多種常見畜禽,也可感染狐貍、熊貓、水貂、獼猴等多種野生動物,當(dāng)動物機(jī)體抵抗力下降時(shí),能夠引起動物泌尿系統(tǒng)感染、腹瀉、菌血癥、敗血癥等[8]。雞奇異變形桿菌病是近幾年發(fā)生的一種細(xì)菌性急性傳染病,種雞感染奇異變形桿可以通過垂直傳播給后代,對雛雞最易感,感染率和死亡率均較高[3]。近幾年,我國關(guān)于雛雞奇異變形桿菌病的報(bào)道愈來愈多。周芳等[5]報(bào)道了從10 日齡的雛雞體內(nèi)分離到了致病性奇異變形桿菌。楊金麗等[6]報(bào)道了在50 日齡的肉雞中分離到致病性奇異變形桿菌。朱明華等[9]報(bào)道了從山東泰安一雞場發(fā)病雛雞眼中分離到1 株致病性奇異變形桿菌。本試驗(yàn)從9 日齡腹瀉致死的雛雞體內(nèi)分離到奇異變形桿菌,并且對雛雞具有很強(qiáng)的致病性。

奇異變形桿菌血清型眾多,疫苗免疫預(yù)防難度比較大,因此,抗菌藥物成為防治雞奇異變形桿病主要的方法。隨著雞奇異變形桿菌病發(fā)生與流行,臨床上由于不合理使用抗菌藥物,導(dǎo)致奇異變形桿菌耐藥菌株不斷地出現(xiàn),并且產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性[10]。本藥敏試驗(yàn)表明,分離菌株對頭孢克肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、丁胺卡那霉素、林可霉素5 種藥物高度敏感;對其他藥物存在不同程度耐藥性。由于奇異變形桿菌具有易產(chǎn)生耐藥性特點(diǎn),當(dāng)發(fā)生該病時(shí),應(yīng)該通過藥敏試驗(yàn)分析其耐藥性,合理使用抗菌藥物,提高治療療效。同時(shí)加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理,減少環(huán)境中的誘因。