哈力亞爾·吾布力 ,迪力穆拉提·玉蘇普 ,米克熱木·沙衣布扎提 ,買占海 ,蘇占強 ,劉英玉 ,張曉紅,姚 剛,夏利寧,張小鶯,吾買爾江·牙合甫,賽福丁·阿不拉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,新疆烏魯木齊830052 ;2.新疆醫(yī)科大學,新疆烏魯木齊 830054)

食品安全目前是每個人最關(guān)注的熱點問題之一,日常生活中絕對離不開畜產(chǎn)品,包括雞、鴨、牛、羊肉等。隨著畜產(chǎn)品的發(fā)展,畜產(chǎn)品中出現(xiàn)的問題越來越多,2017 年3 月15 日“315 國際消費者權(quán)益日”報道少數(shù)養(yǎng)殖場在動物飼料中添加抗生素類等不符合食品安全的藥物,而這種行為的背后存在著巨大的食品安全隱患-抗生素耐藥性,某些抗生素在家畜養(yǎng)殖過程中雖能起到促生長促增肉作用,但產(chǎn)生的耐藥性作用無法挽回,最終通過食物鏈引起人類產(chǎn)生抗生素耐藥性。

大腸埃希氏菌(Escherichia coli.,E.coli)通常被稱為大腸桿菌,屬于大腸桿菌科、埃希氏菌屬,是動物腸道發(fā)現(xiàn)的共生細菌和機會性病原體[1]。牛大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起患牛的急性傳染病[2]。主要表現(xiàn)腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。不同時期感染所表現(xiàn)的臨床癥狀不同,所以該病可分為犢牛黃痢、犢牛白痢和牛水腫病3 種[3]。為控制大腸桿菌引起的疾病多采用抗菌藥物進行治療,但由于濫用抗菌藥物導(dǎo)致的細菌耐藥性成為全球性問題,被世界衛(wèi)生組織定義為21 世紀最大的公共衛(wèi)生安全問題之一[4-5]。由耐藥性致病菌引起動物感染的疾病治療變得更加困難,造成經(jīng)濟負擔。人類的細菌性疾病多也采用抗生素進行治療,而人與動物的抗菌藥物種類在一定程度是相似的,很多抗生素使用只是劑量大小的差異。目前有證據(jù)表明,動物在使用抗生素藥物產(chǎn)生的耐藥性,可經(jīng)傳遞進入人體,造成人類病原菌耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn),對人類疾病治療產(chǎn)生不良影響[6-7]。

本試驗通過對新疆某牛場犢牛不同生長期的牛糞源大腸桿菌進行臨床常用抗菌藥物的耐藥性調(diào)查,掌握不同犢牛不同生長期牛攜帶大腸桿菌的耐藥情況;監(jiān)測牛群大腸桿菌耐藥性的發(fā)展變化動態(tài),有利于掌握動物源耐藥菌的擴散,獲取耐藥性數(shù)據(jù),指導(dǎo)養(yǎng)殖場合理臨床用藥提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2016 年12 月在新疆某肉牛場出生1 -3 月不同日齡犢牛進行樣品采集,利用肛拭子在直腸采集新鮮犢牛源糞200 份。

1.2 試驗藥品及培養(yǎng)基 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、瓊脂、Mueller -Hinton(MH)、乳糖、蛋白胨、溴甲酚紫水溶液、氫氧化鈉等,均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;藥敏片阿莫西林(AMC)、阿莫西林/克拉維酸鉀(APC)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、諾氟沙星(NOR)、氨芐西林(AMP)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMI)等,均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 試驗方法 采集樣品營養(yǎng)肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h,伊紅美藍瓊脂分離大腸菌株,中心暗藍黑色并有綠色金屬閃光的菌落;挑取單菌在麥康凱瓊脂37 ℃培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)形成紅色菌落;提取純化好的單菌落,進行革蘭染色鑒定;配制乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L:蛋白胨20 g、乳糖10 g、0.04%溴甲酚紫水溶液25 mL、用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值7.2～7.4,115 ℃高壓滅菌15 min)觀察產(chǎn)氣;同時將單菌落接到30%甘油30 mL(H2O 70 mL,甘油30 mL,121 ℃高壓滅菌15 min) -20 ℃中保存。

細菌藥敏試驗采用WHO 推薦的Kirby-Bauer法,測定大腸桿菌對3 類抗菌藥物,共8 種藥物的敏感性。依據(jù)美國臨床試驗室標準化委員會(NCCLS)有關(guān)標準,每次測定均以質(zhì)控菌為對照,只有當質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測試菌株結(jié)果才有效。每次試驗重復(fù)3 次,大腸桿菌標準質(zhì)控菌株為ATCC 25922(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院蘇戰(zhàn)強副教授提供)。結(jié)果判定按照NCCLS(2005 年版)進行。按抗菌藥物敏感性試驗擴散法標準判定各菌株的敏感度,對所分離的細菌進行藥敏試驗。以敏感(Sensitivity)、中介(Intermediate)、耐藥(Resistant)3 種形式對抑菌圈大小作出判定。測試各種藥敏紙片對大腸桿菌標準菌株ATCC 25922 產(chǎn)生的抑菌圈大小,觀察抑菌圈直徑是否在要求范圍內(nèi),判斷藥敏片是否合格。具體判斷標準見表1。

表1 藥敏試驗判定標準

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離鑒定 1 -3 月不同日齡犢牛糞源大腸桿菌分離率為100%。樣品伊紅美藍分離大腸菌株,中心暗藍黑色并有綠色金屬閃光的菌落;麥康凱瓊脂培養(yǎng)形成紅色菌落;純化單菌落,革蘭染色顯示陰性小桿菌;乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)氣。

2.2 犢牛糞源大腸桿菌耐藥性分析 200 株犢牛糞源大腸桿菌對8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果見圖1。由圖1 可知,0 -90 日齡200 株犢牛源大腸桿菌主要對阿米卡星(52.5%)1 種抗菌藥耐藥性超過50%,環(huán)丙沙星(30.5%)、諾氟沙星(29%)、恩諾沙星(29%)、慶大霉素(35.5)、阿莫西林(16%)、阿莫西林克拉維酸鉀(16.5%)7 種抗菌藥耐藥性較低,氨芐西林(3.5%)1 種抗菌藥耐藥性最低。

圖1 200 株犢牛糞源大腸桿菌耐藥率分析/%

圖2 不同日齡犢牛糞源大腸桿菌耐藥率分析/%

2.3 不同日齡犢牛糞源大腸桿菌耐藥性分析 0 -30 日齡犢牛糞源大腸桿菌對8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果顯示,氨芐西林(3.03%)、環(huán)丙沙星(13.6%)、阿莫西林(26%)和阿莫西林克拉維酸鉀(36.6%)4 種抗菌藥物敏感,而慶大霉素(57.14%)、諾氟沙星(59.3%)、恩諾沙星(64.5%)和阿米卡星(93.75%)逐漸出現(xiàn)敏感性降低,耐藥性增強現(xiàn)象。31-60 日齡犢牛糞源大腸桿菌對8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果顯示氨芐西林(37%)、阿莫西林克拉維酸鉀(13%)、阿莫西林(14.2%)和諾氟沙星(37.9%)、環(huán)丙沙星(40.7%)5 種抗菌藥敏感率較高,恩諾沙星(50%)、慶大霉素(57.1%)、阿米卡星(81.4%)逐漸出現(xiàn)敏感性降低,耐藥性增強現(xiàn)象。31 -60 日齡犢牛糞源大腸桿菌對8 種臨床常用抗菌藥物的耐藥結(jié)果顯示阿米卡星(7.65%)、慶大霉素(29.75%)、恩諾沙星(36.65%)、諾氟沙星(39.75%)和環(huán)丙沙星(41.34%)5種抗菌藥敏感率較高,而阿莫西林(65%)、阿莫西林克拉維酸鉀(67.3%)和氨芐西林(92.7%)3 種抗菌藥逐漸出現(xiàn)敏感性降低,耐藥性增強現(xiàn)象。整體分析犢牛日齡與耐藥率成正比關(guān)系,耐藥趨勢為阿米卡星>恩諾沙星>諾氟沙星>慶大霉素>阿莫西林克拉維酸鉀>阿莫西林>環(huán)丙沙星>氨芐西林。

3 討論

大腸桿菌是多種動物傳染性治病的病原菌,可在腸道大量繁殖,對抗生素的過度使用和濫用,使動物體內(nèi)大腸桿菌的耐藥性越來越嚴重,未被分解的抗生素和耐藥菌隨糞便排出體外污染食品、水源、環(huán)境并引起人類感染[8]。大腸桿菌耐藥性廣泛,在動物疾病的防治過程中慎用阿莫西林、恩諾沙星、諾氟沙星及環(huán)丙沙星?？股厮幬锸褂们绊毨盟幟粼囼瀬磉x擇敏感性較強的藥物進行使用,此外也可與其他抗菌藥物聯(lián)合使用來進行動物疾病防治。這樣在增加療效的的同時,也可以減少細菌耐藥性。動物源細菌耐藥性的迅速出現(xiàn),不僅使原有的抗菌藥物失去作用,導(dǎo)致動物疾病難以控制,而且這些耐藥菌很有可能通過污染環(huán)境、食品或人與動物的接觸傳播給人,對人類的健康帶來更大的傷害。

獸醫(yī)臨床治療中氨基糖苷類為堿性抗菌藥,對需氧革蘭陰性桿菌、結(jié)核桿菌和金黃色葡萄球菌作用強。結(jié)果顯示200 株糞源大腸桿菌對氨基糖苷類抗菌藥耐藥性較嚴重,其中阿米卡星耐藥性達到52.5%,超過50%檢測株數(shù),此外慶大霉素耐藥性達到35.5%,導(dǎo)致此現(xiàn)象原因可能是犢牛在幼齡期消化系統(tǒng)未發(fā)育完全,冬季環(huán)境因素易導(dǎo)致犢牛消化不良,多數(shù)犢牛出現(xiàn)腹瀉病理,慶大霉素在獸醫(yī)臨床中主要用于下瀉,消化功能紊亂,因此慶大霉素大量使用導(dǎo)致耐藥性高。此外慶大霉素對幼畜/新生幼兒產(chǎn)生腎毒性和不可逆的耳毒性,建議限用或禁用[9-11]。

氟喹諾酮類是殺菌性抗菌藥,目前獸醫(yī)領(lǐng)域使用藥物種類10 余種,對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、衣原體、支原體作用更強[12]。結(jié)果顯示,環(huán)丙沙星(30.5%)、諾氟沙星(29%)、恩諾沙星(31.5%)3種抗菌藥耐水平均在30%(29%～31.5%),說明該場牛源大腸桿菌對氟喹諾酮類抗菌藥可能存在交叉耐藥。沙星類抗菌藥物廣泛應(yīng)用到牛、豬和禽類等動物的肺部感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染及支原體引起的疾病。冬季容易造成細菌、支原體引起肺炎或成群感染。因此治療階段沙星類藥物和TMP 進行配合使用,增強沙星類藥物的抗菌療效,與磺胺、對氨基苯甲酸配合使用有協(xié)同作用,提高療效,避免單類抗菌藥重復(fù)使用造成耐藥性上升[13]。

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌類等作用強,結(jié)果顯示氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林克拉維酸鉀3 種抗菌藥耐藥性均低于20%,其中氨芐西林耐藥性僅為3.5%。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥耐藥率最低,但日常治療過程中建議采取聯(lián)合用藥方式就診。從不同日齡犢牛源大腸桿菌耐藥率分析,犢牛日齡與耐藥率成正比關(guān)系,耐藥趨勢為阿米卡星>恩諾沙星>諾氟沙星>慶大霉素> 阿莫西林克拉維酸鉀> 阿莫西林> 環(huán)丙沙星>氨芐西林。該場耐藥性日益嚴重,這種產(chǎn)生的原因可能是由于濫用和不合理使用抗菌藥物導(dǎo)致耐藥性通染色體或其他在細菌間傳播,致使正常大腸桿菌對藥物環(huán)境的適應(yīng)性逐漸增強,耐藥基因在細菌間相互傳遞和蔓延,因此導(dǎo)致多重耐現(xiàn)象的發(fā)生,使聯(lián)合用藥藥效降低影響動物疾病的防治,養(yǎng)殖戶成本增加。