(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京海淀 100193)

小鵝瘟是危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病,以精神萎頓、食欲廢絕和嚴(yán)重下痢為主要臨床癥狀,以腸道出現(xiàn)栓子狀物為特征病變[1]。3 周齡以內(nèi)雛鵝對(duì)本病高度易感,如果未進(jìn)行免疫,1 周齡以內(nèi)雛鵝死亡率可達(dá)90%以上[2]。該病病原是鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV),目前歸屬為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科依賴細(xì)小病毒屬(http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)。GPV 為無囊膜的病毒,其基因組為單股DNA,含2 個(gè)開放閱讀框(Open reading frame,ORF),左側(cè)ORF 編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS),右側(cè)ORF 編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2 和VP3)[3]。免疫接種是控制小鵝瘟的有效措施[1-2],通常用弱毒疫苗免疫種鵝,通過母源抗體對(duì)后代提供保護(hù),但母源抗體的保護(hù)往往不夠,還需在后代雛鵝出殼后用小鵝瘟抗體制品進(jìn)行被動(dòng)免疫。在有些鵝場(chǎng),則僅依靠小鵝瘟抗體制品對(duì)本病進(jìn)行控制。

2018 年6 月22 日,安徽某鵝場(chǎng)9 日齡和12 日齡的鵝群發(fā)生小鵝瘟,這兩批雛鵝在出殼時(shí)均接種過小鵝瘟抗體。發(fā)病時(shí),用2 種不同來源的小鵝瘟抗體產(chǎn)品進(jìn)行控制,效果存在明顯差異。本試驗(yàn)旨在對(duì)其病原進(jìn)行分子鑒定和抗原性分析,并對(duì)抗體產(chǎn)品的效價(jià)進(jìn)行檢測(cè),以便為小鵝瘟的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例 8 只病死鵝用于本試驗(yàn),包括9 日齡鵝5 只、12 日齡鵝3 只,由安徽某鵝場(chǎng)于2018 年6 月26 日送檢。

1.2 毒株和抗體 GPV H 株和JS1 株由本實(shí)驗(yàn)室保存,2 種不同來源的小鵝瘟病毒精制蛋黃抗體(編號(hào)為A 和B)由養(yǎng)殖戶提供,用于抗原相關(guān)性分析和抗體效價(jià)測(cè)定。

1.3 樣品采集與處理 采集病死鵝肝臟和腎臟樣品,按1∶5(w/v)比例加入生理鹽水,研磨制成勻漿,在4 ℃條件下用12 000 g 離心15 min,收獲上清液,用于DNA 提取,其中2 份(AC1 和AC2)作為待檢抗原,用于瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)(Agar gel precipitin,AGP)。

1.4 PCR 檢測(cè) 用組織/細(xì)胞基因組DNA 快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取DNA。取DNA 5 μL,加入2 ×TaqMaster Mix 12.5 μL、上游和下游引物(表1)各1 μL、ddH2O 5.5 μL。在95 ℃預(yù)變性10 min,按95 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃30 s 的程序運(yùn)行35 個(gè)循環(huán),在72 ℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 產(chǎn)物。用文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道的引物(表1)分別擴(kuò)增539 bpVP3 和645 bpVP1 序列。

表1 PCR 檢測(cè)所用引物

1.5 克隆、測(cè)序和序列分析 按文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方式回收PCR 產(chǎn)物、克隆至pCloneEZ 質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化DH10b 感受態(tài)細(xì)胞,取陽性菌液,委托天一輝遠(yuǎn)(北京)生物科技有限公司測(cè)序。按文獻(xiàn)[5 -6]報(bào)道的處理方式,從VP1 序列中截取443 bp 序列,從Gen-Bank 下載12 株GPV 分離株的VP1 序列作為參考序列,用CLUSTALW(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)進(jìn)行在線比對(duì),用MEGA6.0 軟件[7]進(jìn)行演化分析。

1.6 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP) 稱取1 g 瓊脂糖、8 g NaCl,溶于100 mL 蒸餾水,加熱溶解,稍冷卻后倒入培養(yǎng)皿。待瓊脂糖凝固后,用梅花打孔器打孔,在中央孔加入GPV 抗原,用生理鹽水將小鵝瘟A 抗體和B 抗體分別進(jìn)行2 倍系列稀釋,并依次加入到外圍孔,以出現(xiàn)沉淀線的抗體最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價(jià)。在中央孔加入GPV B 抗體(1 ∶4稀釋),在外圍孔加入GPV H 株、JS1 株和待檢抗原,以此分析待檢毒株與參考毒株之間的抗原相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢 病死鵝有小鵝瘟典型病變,即在小腸見有一處腸段外觀膨脹,剖開見有栓子樣物,中插彩版圖1 為1 只12 日齡病死鵝的腸道病變。

圖1 12 日齡病死鵝的腸道病變

2.2 PCR 檢測(cè) 用引物對(duì)VP3 F/VP3 R 進(jìn)行PCR檢測(cè),從16 份組織樣品中均擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度的條帶(圖2)。

圖2 臨床樣品中GPV 的PCR 檢測(cè)

2.3 序列同源性分析和遺傳演化分析 測(cè)定了8株GPV 的部分VP1 序列。CLUSTALW 分析結(jié)果顯示,在443 ntVP1 區(qū),所測(cè)毒株之間的序列同源性為100%,與亞洲強(qiáng)毒分支的序列同源性可達(dá)99%,與匈利亞強(qiáng)毒分支、疫苗和低毒力分支的序列同源性均為96%,與GPV 西歐分支毒株的序列同源性為94%。用443 ntVP1 序列進(jìn)行遺傳演化分析,如圖3所示,所測(cè)8 株GPV 聚為GPV 亞洲強(qiáng)毒株分支。

圖3 GPV 遺傳演化分析

2.4 AGP 用GPV JS1 株作為抗原進(jìn)行檢測(cè),B抗體與抗原之間形成清晰可見的沉淀線,效價(jià)為1∶16。而A 抗體與抗原之間僅見微弱的沉淀反應(yīng),抗體效價(jià)為1 ∶2左右。將B 產(chǎn)品作為抗體進(jìn)行檢測(cè),待檢樣品AC1 和AC2 與GPV H 株和JS1 株抗原之間形成的沉淀線彼此融合(圖4)。

圖4 GPV 的抗原性分析

3 討論

送檢病例具有小鵝瘟的特征性腸道病變,據(jù)此可初步診斷為小鵝瘟。用水禽細(xì)小病毒的特異性PCR[4]進(jìn)行檢測(cè),從8 只病例的肝臟和脾臟樣品中均檢出GPVVP3 序列,因發(fā)病雛鵝及其種鵝均未免疫小鵝瘟弱毒疫苗,因此,可認(rèn)為所檢出的GPV 均屬?gòu)?qiáng)毒株。按文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方式對(duì)VP1 部分序列進(jìn)行遺傳演化分析,可將所測(cè)毒株歸屬于GPV 亞洲強(qiáng)毒分支。結(jié)合沉淀反應(yīng)模式,結(jié)果表明,用小鵝瘟抗體制品進(jìn)行免疫仍未能徹底控制疾病發(fā)生,并非源自病毒變異。

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可用于GPV 抗體的評(píng)估[8]。用該法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明,A 抗體產(chǎn)品比B 抗體產(chǎn)品的效價(jià)低3 個(gè)滴度,此結(jié)果可解釋這2 種抗體制品在控制小鵝瘟?xí)r的效果差異。據(jù)養(yǎng)殖戶介紹,用A 抗體進(jìn)行緊急接種,鵝群日死亡率仍在5%左右;用B 抗體免疫后,鵝群日死亡率明顯降低,但需增加免疫劑量。由此可見,確保抗體制品的效價(jià)對(duì)于小鵝瘟的控制至關(guān)重要。由于GPV 可經(jīng)卵垂直傳播,或經(jīng)孵化器污染而傳播[1-2],加強(qiáng)種鵝場(chǎng)和孵化環(huán)節(jié)的衛(wèi)生管理與消毒,特別是做好種鵝的疫苗免疫,對(duì)于后代雛鵝小鵝瘟的控制是有益的。