溫峰琴 ,項海濤 ,郝寶成 ,邢小勇 ,包世俊 ,胡永浩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,甘肅蘭州730070 ;2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅蘭州 730050)

犬細小病毒感染是由犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的犬的一種急性傳染病,特征為出血性腸炎或非化膿性心肌炎,多發(fā)生于幼犬,病死率10%～50%[1]。

CPV 屬于細小病毒科細小病毒亞科的Protopar-vovirus屬,與貓細小病毒(FPV),水貂腸炎病毒(MEV)和浣熊細小病毒(RaPV)均為食肉動物原細小病毒1 的變種[2]。CPV 是一類結(jié)構(gòu)簡單的單鏈線狀DNA 病毒,病毒顆粒直徑約為25 nm,無囊膜,呈二十面體[3]。病毒基因組全長為5 323 nt,含有2個ORF,5′端主要編碼早期轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白NS1 和NS2,3′端編碼晚期轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)蛋白,即病毒衣殼蛋白VP1 和VP2,VP2 是衣殼蛋白的主要成分,具有較強的免疫原性,可用于制備亞單位疫苗或DNA疫苗[4]。

由于犬細小病毒,尤其是VP2 基因容易發(fā)生變異,且在同一動物體有時能夠檢測到幾種病毒變體,即共同感染[2],對VP2 序列的擴增和分析有助于了解流行毒株的抗原和基因變異情況。由于VP2的突變和重組影響宿主范圍和受體結(jié)合的親和力,因此對毒株VP2 基因的監(jiān)測有助于了解流行株與疫苗株的關(guān)系及CPV 的進化模式,本試驗對蘭州分離的2 例犬細小病毒VP2 進行遺傳進化分析及氨基酸變異分析,為犬細小病毒病的分子流行病學調(diào)查及防控提供了數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 2 例犬細小病毒病患病犬糞便均來自蘭州某寵物醫(yī)院,采集時間分別為2017 年4 月和2017 年6 月。

1.2 試劑 2 ×TaqPCR Master Mix、病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒,購自TIANGEN 公司;膠回收試劑盒,購自O(shè)MEGA 公司;DL-2 000 DNA Marker,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;pMD19-T Vector,購自TaKaRa 公司;IPTG、X-gal、DH5α,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計 參照NCBI 數(shù)據(jù)庫犬細小病毒VP2 基因保守區(qū)設(shè)計擴增全長的引物,引物序列包含酶切位點,由金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如下:

VP2-forward:5′ATACATATGAGTGATGGAGCAGTTCAACC 3′

VP2-reverse:5′TATGGATCCTTAATATAATTTTCTAGGTG 3′

1.3.2 病毒基因組DNA 提取 2017 年4 月分離的病毒株命名為CPV/canine/LZ/1/2017,2017 年7 月分離的病毒命名為CPV/canine/LZ/2/2017,按照TIANGEN 病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒說明書進行。

1.3.3VP2 基因的擴增 PCR 反應(yīng)體系:2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL,ddH2O 23 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,模板1 μL,總體積50 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃1 min,53 ℃40 s,72 ℃90 s,30 次循環(huán);72 ℃10 min。擴增后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳后切取目的條帶,用膠回收試劑盒進行純化回收。

1.3.4 連接與轉(zhuǎn)化 膠回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接。連接體系為10 μL,其中SolutionI 5 μL;pMD19-T 載體2 μL;膠回收產(chǎn)物3 μL;16 ℃連接30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL 感受態(tài)大腸桿菌DH5α。冰浴30 min,42 ℃熱激45 s,冰浴2 min。在上述感受態(tài)細胞中加入950 μL 不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h。用移液器吸取100 μL培養(yǎng)液涂布含有IPTG、X-gal 和氨芐青霉素的LB 平板培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 -16 h。

1.3.5 陽性重組質(zhì)粒的鑒定 挑取平板中的白斑(陽性)于含氨芐青霉素的LB 肉湯中37 ℃搖床中培養(yǎng)8 h 至菌液渾濁;吸取少量菌液進行菌液PCR 擴增,PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳,觀察是否出現(xiàn)目的條帶。取出現(xiàn)目的條帶的菌液1 mL,離心,棄上清,送金唯智生物科技有限公司測序。

1.3.6 序列測定與分析:將臨床分離株VP2 基因序列與NCBI 中的24 株犬細小病毒及3 株貓細小病毒VP2 基因序列用MEGA7.0 進行比對分析,并繪制遺傳進化樹。用MegAlign 軟件分析核苷酸同源性,同時分析氨基酸變異情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增結(jié)果 PCR 擴增產(chǎn)物大小約為1 700 bp,與預期一致,如圖1 所示。

圖1 犬細小病毒VP2 基因PCR 產(chǎn)物電泳

2.2 核苷酸遺傳進化及同源性分析 測序結(jié)果顯示,2 株病毒VP2 基因大小為1 755 bp,CPV/canine/LZ/1/2017VP2 基因 NCBI 登錄號分別為MH155192,CPV/canine/LZ/2/2017VP2 基 因MH155193。遺傳進化分析顯示,貓細小病毒和犬細小病毒明顯位于不同的進化分支上,MH155192 與MF467233.1、JQ743891.1 和KY937659 進化關(guān)系較近,位于同一進化分支。MH155193 與KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1 進化關(guān)系較近,位于另一獨立的進化分支上,如圖2 所示。核苷酸同源性分析顯示,MH155192 與MF467233.1 和JQ743891.1 的核苷酸同源性最高,均為99.9%,與MG264078.1 同源性較低(99%)。MH155193 與KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1 核苷酸同源性均為99.8%,與KF149967.1 同源性較低(99.1%),MH155192 和MH155193 同源性為99.3%,如表1所示。

圖2 犬細小病毒臨床分離株VP2 基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 氨基酸變異分析 MH155192 在易發(fā)生變異的位點氨基酸分別為5A,80R,87 L,93 N,101T,103A,178D,212F,232I,267Y,297A,300G,305Y,322T,323N,324I,370R,373D,426D,440A,564S,568G。各毒株之間氨基酸差異明顯的位點主要在267、324、370、426、440 位,如表2 所示。MH155192 和MH155193 共有13 個核苷酸差異,其中的10 個核苷酸的變化僅造成同義突變,而3個核苷酸突變導致氨基酸改變,分別位于370、426 和440 位殘基?？傮w來看,在24 株犬細小病毒中,中國分離株267 位均為Y,324 位均為I,與美國、厄瓜多爾分離株差異明顯,370 位中國分離株為Q 或R。CPV-2c分離株440 位均為T。

表1 犬細小病毒臨床分離株VP2 基因同源性分析

表2 VP2 蛋白氨基酸變異情況

3 討論

犬細小病毒,為將其與抗原無關(guān)的犬科動物微小病毒(MVC 或CPV1) 區(qū)分開來,也稱為CPV2,1978 年出現(xiàn)在美國,并迅速蔓延在世界各地的狗群中引起居高不下發(fā)病率[5]。在1979 年和1984 年,CPV-2a 和2b 兩種新抗原類型分別取代了原來的CPV-2,獲得了在貓中高效復制的能力。CPV-2a 和CPV-2b 至少在VP2 衣殼蛋白上有5 個或6 個氨基酸與最初的CPV2 不同。在CPV-2a 和CPV-2b 中VP2 第297 位(Ser→Ala)的額外氨基酸改變產(chǎn)生了“新CPV-2a”和“新CPV-2b”。此外,在2000 年報道了另一種抗原變體,其特征在于氨基酸替代426-Asp→Glu。這種CPV-2c 隨后在全球范圍內(nèi)被報道,并與嚴重的臨床病程相關(guān),死亡率較高[6]。CPV-2a (Met87Leu,Ile101Thr,Ala300Gly,Asp305Tyr,Asn375Asp,和Val555Ile 氨基酸變體) 和 CPV-2b (Asn426Asp),CPV-2c(Asp426Glu)僅有1 個氨基酸位置不同(VP2 426 殘基)[7]。VP2 的426 和297 位氨基酸在空間上分別接近衣殼表面上三倍體突起的殘基97 和300 。結(jié)構(gòu)研究表明,該區(qū)域與宿主細胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)相互作用以介導感染,限制宿主范圍,并且具有很高的抗原性[6]。近年來中國分離株CPV-2a,CPV-2b,CPV-2c 三種類型都有。在本文氨基酸分析的24 株病毒中,除KJ813835.1 第297 位為Ser外,其余菌株都為Ala,故認為CPV/canine/LZ/1/2017 和CPV/canine/LZ/2/2017 分別是新CPV-2b和CPV-2c。尤其CPV-2c 甚至能引起成年犬的嚴重疾病,應(yīng)引起重視。

一般氨基酸替換發(fā)生于K80R,K93 N,V103A,D323N,N564S 和A568G,在本文的氨基酸序列分析中發(fā)現(xiàn),不同毒株之間的主要突變發(fā)生在F267Y,Y324I,Q370R,N426D 或D426E,T440A。這些突變可能會導致病毒通過抗原漂移免疫逃避和隨之而來的疫苗失敗。在非同義突變中,氨基酸殘基267 未暴露于衣殼表面,因此在這個位置的替代可能不會影響病毒的抗原性。Y324I 突變常見于亞洲國家特別是中國和南美。該突變可能對細小病毒宿主范圍有影響,且由于Y324I 突變發(fā)生在潛在的重要的抗原表位區(qū)域,這個替代可能對病毒生物學有直接影響。T440A 突變對于CPV 也很重要,因為殘基440 位于衣殼表面VP2 的3 倍體突起的頂部,主要的病毒抗原位點。因此導致其他抗原性變體出現(xiàn)[8]。臺灣CPV-2c 毒株VP2 蛋白也存在Q370R 的替代,突變Q370R 在中國的大熊貓和中國的CPV-2c 株中觀察到。370 殘基位于殘基359 和375 之間(它是衣殼蛋白的表面環(huán)),毗鄰雙Ca2+結(jié)合位點,這些對于病毒感染性是必不可少的,這些位點的改變與病毒凝集紅細胞的能力相關(guān)[9]。因此,Q370R 變異是否導致抗原變化仍有待調(diào)查。總的來說,進一步研究犬細小病毒流行毒株的基因變異情況,以及變異引起的生物學特性的變化對于該病的防控有重要意義。