林彥星 ,徐 錚 ,曹琛福 ,黃超華 ,王 瀟 ,張彩虹 ,楊俊興,花群義

(1.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東深圳518045 ;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州510642 ;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus)、A 型塞內(nèi)卡病毒(SenecavirusA)的唯一成員,為不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒[1]。最初SVV 被認(rèn)為是一種非致病性病毒,有關(guān)SVV 的研究主要是作為溶瘤病毒用于治療人類某些神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[2-3]。2014 年巴西暴發(fā)大規(guī)模SVV 導(dǎo)致仔豬死亡,國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)對(duì)該病毒才重視起來[4-5]。2015 年我國(guó)研究人員首次分離到SVV 中國(guó)毒株并測(cè)定了其全基因組序列[6],近兩年來我國(guó)先后有湖北、福建、河南、廣東等省部分豬場(chǎng)出現(xiàn)SVV 感染的情況[7-9]。

該病是近年來發(fā)現(xiàn)的由塞內(nèi)卡谷病毒感染引起豬出現(xiàn)水泡性病變的一種傳染病。其特征是引起豬鼻鏡及蹄冠處出現(xiàn)水皰、潰爛創(chuàng)面從而導(dǎo)致跛足甚至死亡,臨床癥狀與口蹄疫(Foot-and mouth disease,FMD)、豬水皰病(Swine vesicular disease,SVD)等我國(guó)一類動(dòng)物傳染病相似,建立及時(shí)準(zhǔn)確的診斷檢測(cè)方法對(duì)疫病防控意義重大。目前國(guó)外已經(jīng)建立了多種檢測(cè)SVV 病原檢測(cè)方法,如電子顯微鏡檢查、免疫組化、RT-PCR、熒光定量RT-PCR、新型RNA 原位雜交技術(shù)等均可用于SVV 的鑒別檢測(cè)[10-12]。本研究通過設(shè)計(jì)特異性的引物和探針,建立了檢測(cè)SVV 的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法,為有效防控塞內(nèi)卡病毒病提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒、核酸樣品和細(xì)胞 塞內(nèi)卡谷病毒(SVV)由本室保存。水皰性口炎病毒(VSV)、豬水皰病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等滅活病毒抗原以及PK15 細(xì)胞均由本動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 見參考文獻(xiàn)[13]。

1.3 引物探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank 中公布的SVV 基因序列(KT321458.1),針對(duì)3D 和VP1目的基因,設(shè)計(jì)多對(duì)普通RT-PCR 引物和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 引物及探針組合,利用BLAST 初步比較其特異性。引物探針合成后通過試驗(yàn)篩選并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 病毒核酸的提取 采用病毒RNA 抽提試劑盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit 在全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)上提取病毒核酸,用50 μL 洗脫液洗脫,并用超微量核酸蛋白濃度分析儀測(cè)定所提取核酸濃度。SVV 陽(yáng)性對(duì)照樣品,先制備PK15 單層細(xì)胞,將SVV 接種于PK15 細(xì)胞,每日觀察細(xì)胞病變,待細(xì)胞病變達(dá)75%時(shí),收獲病毒培養(yǎng)液,同法提取病毒核酸。

1.5 普通RT-PCR 擴(kuò)增 使用一步法RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒(QIAGEN),分別以SVV、VSV-IND、VSVNJ、SVDV、FMDV、CSFV 和PRRSV 等核酸為模板進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè),并以無(wú)核酸酶水(DEPC 水)為模板作為空白對(duì)照。RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 特異性試驗(yàn) 采用一步法熒光定量RT-PCR 試劑盒(ABI),以SVV、VSV-IND、VSV-NJ、SVDV、FMDV、CSFV 和PRRSV 等病毒核酸為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè),并以DEPC 水作為空白對(duì)照。

1.7 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 靈敏度試驗(yàn) 用DEPC 水對(duì)所SVV 核酸做10 ×系列稀釋,以稀釋的核酸為擴(kuò)增模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試驗(yàn)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn) 采用1.2.5中3 份不同濃度(10-1～10-3)的SVV 核酸模板進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。根據(jù)Ct值變異系數(shù)(CV)進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)。

1.9 臨床樣品檢測(cè) 利用本研究所建立的方法,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集的116 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),并以SVV 核酸作為陽(yáng)性對(duì)照,DEPC 水作為陰性對(duì)照;同時(shí)也采用普通RT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 引物探針篩選 通過試驗(yàn)篩選出特異敏感的普通RT-PCR 引物和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 引物探針(見表1)。

表1 RT-PCR 引物和探針序列

2.2 反應(yīng)條件的確立 按照RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒說明書要求,在25 μL 反應(yīng)體系中,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),RNA 核酸模板5 μL,用DEPC 水補(bǔ)足25 μL。經(jīng)過對(duì)退火溫度和時(shí)間的優(yōu)化,確定RT-PCR 最佳反應(yīng)條件:50 ℃30 min;95 ℃15 min;94 ℃30 s,52 ℃40 s,72 ℃1 min,40 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 反應(yīng)體系同樣為25 μL,其中上下游引物各1 μL(10 μmol/L),探針0.5 μL(10 μmol/L),模板5 μL;按試劑盒推薦的反應(yīng)條件:45 ℃10 min;95 ℃10 min;95 ℃15 s,60 ℃45 s(收集FAM 熒光),40 個(gè)循環(huán)。

2.3 普通RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 普通RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示,僅SVV 核酸模板出現(xiàn)約372 bp 條帶,大小與預(yù)期相符,PCR 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后通過GenBank Blast 比對(duì)分析,表明擴(kuò)增片段與目的基因相符,為SVV 核酸序列;其他核酸模板及空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖1)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果 以SVV、SVDV、VSV-IND、VSV-NJ、FMDV、CSFV 和PRRSV等核酸為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示,以SVV 核酸為模板的反應(yīng)孔收集到FAM熒光信號(hào),出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,而其他核酸模板和空白對(duì)照都未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(見中插彩版圖2),表明該方法特異性強(qiáng),能準(zhǔn)確檢測(cè)SVV 核酸,與其他病原無(wú)交叉反應(yīng)。

圖1 普通RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)得所提取核酸濃度為0.72 μg/mL。用DEPC 水將SVV核酸做10 × 系列稀釋(100～10-6)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試驗(yàn),最低可以檢測(cè)到本試驗(yàn)所抽提核酸10-4稀釋度(見中插彩版圖3),對(duì)應(yīng)的核酸濃度為7.2 ×10-5μg/mL。

圖3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.6 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn) 取10-1～10-3稀釋的共3 個(gè)濃度的SVV 核酸模板分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。根據(jù)Ct值計(jì)算出批內(nèi)變異系數(shù)(CV)0.93%～ 2.47%,批間變異系數(shù)(CV)1.25%～2.76%,表明該方法重復(fù)性良好(見表2)。

表2 不同SVV 核酸濃度的重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 臨床樣品的檢測(cè) 為驗(yàn)證本研究建立的檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值,用所建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法對(duì)從華南一些豬場(chǎng)收集和企業(yè)或養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的病豬內(nèi)臟(32 份)、水皰液(13 份)、口腔拭子(54)、糞便樣品(17 份)等共計(jì)116 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),并以SVV 核酸作為陽(yáng)性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果顯示,7 份臨床樣品出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,其中內(nèi)臟5 份,水泡液2 份,與普通RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

SVV 是近年來新發(fā)現(xiàn)的病毒之一。雖然現(xiàn)有資料顯示SVV 不具備FMDV 的危害性,大多數(shù)成年豬感染后預(yù)后良好,未引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生后果和經(jīng)濟(jì)損失。但SVV 感染的臨床癥狀類似于FMDV、SVDV、VSV 等其他幾種水皰性疾病的病毒感染,使得感染豬只的上市存在重大的風(fēng)險(xiǎn)和隱患,也使疫病針對(duì)性防控帶來困難。近年來SVV 在巴西、美國(guó)和我國(guó)幾乎同時(shí)發(fā)生,說明有進(jìn)一步擴(kuò)大和暴發(fā)的可能,且局部地區(qū)傳播速度快,仔豬致死率較高,其潛在影響是不可估量的,不得不引起足夠的重視。我國(guó)現(xiàn)已有4 個(gè)省份部分豬場(chǎng)感染SVV 的報(bào)道[6-9],尚不知其他地區(qū)是否也存在SVV 感染情況,一旦大規(guī)模暴發(fā)可能會(huì)給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,我國(guó)農(nóng)業(yè)部制定的《2018 年獸醫(yī)工作要點(diǎn)》中就明確提出做好塞內(nèi)卡病毒病等新傳入疫病的防治工作[14]。另外,我國(guó)每年都會(huì)進(jìn)口大量冷凍豬肉,種豬及其遺傳物質(zhì)(胚胎、精液)進(jìn)口數(shù)量也較大。為防止該病的新病毒株從國(guó)外傳入我國(guó),必須盡快研究建立快速檢測(cè)和鑒別方法。

本研究針對(duì)3D 和VP1 基因片段較保守區(qū),設(shè)計(jì)并通過大量試驗(yàn)篩選出特異敏感的普通RT-PCR引物和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 引物探針,建立了檢測(cè)SVV 的普通RT-PCR 和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法。試驗(yàn)過程中考慮到利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品,無(wú)法真實(shí)反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄過程,且制備過程中產(chǎn)生的DNA殘留難以去除,因此本試驗(yàn)利用滅活病毒作為陽(yáng)性品可以有效監(jiān)控病毒核酸檢測(cè)的全過程,以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。通過對(duì)116 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),并以SVV 核酸作為陽(yáng)性對(duì)照,檢測(cè)結(jié)果顯示7 份臨床樣品出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,與普通RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果一致。本研究建立的SVV 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 快速檢測(cè)方法具有較高的推廣應(yīng)用價(jià)值,可用于SVV的快速檢測(cè),對(duì)塞內(nèi)卡病毒病的防控具有重要的意義。