(山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心,山東濟(jì)南 250022)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性的腸道疾病。該病毒主要破壞豬的消化道器官,其主要臨床癥狀為急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水。1971年,英國(guó)首次報(bào)道了PED 的發(fā)生[1]。1978 年,英國(guó)和比利時(shí)首次鑒定PEDV 的基因組大小約為28 kb,是具有感染性的、有囊膜、不分節(jié)段的、單股正鏈RNA 病毒。PEDV 基因組從5′→3′依次為5′端非編區(qū)(5′untranslated region,UTR),6 個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frames,ORFs)和3′UTR,其中5′端含有帽子結(jié)構(gòu),3′端含有Poly(A)尾巴,6 個(gè)開(kāi)放閱讀框包括復(fù)制酶基因(ORF1a,ORF1b)和結(jié)構(gòu)基因(S、ORF3、M、N)[2]。ORF3 屬于附屬蛋白,在病毒復(fù)制的過(guò)程中,一般不需要附屬蛋白的參與,但附屬蛋白的表達(dá)可能對(duì)病毒適應(yīng)體外培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生影響。將病毒在細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代后,就很容易從中挑選出附屬基因缺失的毒株,而其缺失可以導(dǎo)致病毒的至弱[3],因此現(xiàn)認(rèn)為ORF3 蛋白的功能與病毒的毒力有關(guān),并為強(qiáng)、弱毒株提供了鑒定依據(jù)。

本試驗(yàn)對(duì)2017 年1 月-2018 年6 月山東省13地市仔豬臨床表現(xiàn)為腹瀉癥狀的規(guī)?；i場(chǎng)開(kāi)展了病原檢測(cè)和ORF3 基因分析,為更好的PEDV 防控提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 研磨儀、PBS、離心機(jī)、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀、AB 熒光定量PCR 儀,均由本實(shí)驗(yàn)室提供;病毒DNA/RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Prime Script One Step RT-PCR kit Ver.2、pMD18-T Simple Vector、克隆宿主菌E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞、DL-2 000 DNA Marker,均購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank 已登錄的PEDV序列JQ282909 的ORF3 基因,利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)PEDV 的ORF3 基因擴(kuò)增引物(ORF3f:5′-CCTAGACTTCAACCTTAC-3′;ORF3r:5′-GAAAAAGAGTACGAAAAG-3′)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 于2017 年1 月-2018 年6 月,從山東省德州、泰安、煙臺(tái)、濟(jì)寧、濟(jì)南、日照、菏澤、臨沂、濱州、濰坊、聊城、淄博和東營(yíng)13 個(gè)地市豬場(chǎng)采集腹瀉仔豬的小腸及內(nèi)容物、新鮮糞便和血清等樣品共105 份。

1.2.2 RNA 的提取 將采集的豬小腸及內(nèi)容物、糞便放入1.5 mL 離心管中,加入磁珠、1 mL PBS,用組織研磨儀研磨,離心取200 μL 上清。按照AxyPrep 體液病毒RNA Extraction Kit 步驟進(jìn)行RNA的提取。

1.2.3 陽(yáng)性病料的篩選和ORF3 基因的擴(kuò)增與克隆 利用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒(世紀(jì)元亨)將鑒定陽(yáng)性的病料用于ORF3 基因的克隆。用PEDVORF3 引物對(duì)樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μL。模板RNA 2 μL,RNase Free dH2O 17 μL,2 ×1 Step Buffer 25 μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL,上下游引物各2 μL。條件:50 ℃30 min,95 ℃5 min,1 個(gè)循環(huán);94 ℃30 s、50℃30 s、72 ℃30 s,30 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),篩選出陽(yáng)性樣本。膠回收產(chǎn)物連接于pMD18-T 載體中,將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4ORF3 基因的遺傳進(jìn)化分析 將獲得的序列命名并上傳NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù),利用Meg Align 軟件將本試驗(yàn)獲得的ORF3 基因序列與我國(guó)其他地區(qū)的代表株、國(guó)外分離株及PEDV 經(jīng)典株的ORF3 基因進(jìn)行同源性分析比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1ORF3 目的基因擴(kuò)增與序列測(cè)定 2017 -2018 年,來(lái)自山東省13 個(gè)不同地市的105 份腹瀉病料中,利用M 系列引物檢出68 份陽(yáng)性,年均檢出率為64.8%。利用ORF3f 與ORF3r 一對(duì)特異性引物篩選出28 株具有代表性的陽(yáng)性病毒株。將篩選出的28 株ORF3 序列連接T 載體測(cè)序,從中擴(kuò)增ORF3 全基因,大小為675 bp,部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PEDV ORF3 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 基因序列比對(duì) 利用Meg Align 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)基因的缺失,只是發(fā)生個(gè)別基因的突變。28 株ORF3 基因彼此同源性為94.2%～100%,編碼氨基酸同源性為94.7%～99.6%。與歐洲經(jīng)典毒株CV777 基因同源性為95.4%～96.9%,氨基酸同源性為94.4%～96.0%。28 株序列號(hào)分別是MH580562-MH580589。毒株的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

與CV777 相比,本試驗(yàn)獲得的28 個(gè)ORF3 序列在8 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生相同的氨基酸的變異(A21V,I54V,I79V,F92L,V80S,I101A,S166N),同時(shí)還存在一些特異性的突變(L3S,G4W,L5T,Q7S,T9M,L25S,I70M,L72S,L81I,L132P,G150V,N168D,H182Q)。與疫苗株Attenuated Chinese PEDV 相比,不存在82～99氨基酸位點(diǎn)上18 個(gè)氨基酸的連續(xù)缺失現(xiàn)象,結(jié)果驗(yàn)證本試驗(yàn)分離得到的28 株序列均為野毒株。

表1 分離毒株信息

2.3ORF3 全基因遺傳進(jìn)化分析 將28 株本試驗(yàn)分離的ORF3 基因與NCBI 已上傳部分ORF3 基因做遺傳進(jìn)化分析(表2),遺傳拓?fù)鋱D(圖2)呈現(xiàn)2 個(gè)明顯的分枝,經(jīng)典毒株與弱毒株代表的G1 和當(dāng)代流行毒株群代表的G2。G1 包含2006 年在甘肅分離得到的中國(guó)毒株LZC 和1978 年在比利時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的PEDV 歐洲株CV777,以及1 個(gè)韓國(guó)弱毒株和3 個(gè)中國(guó)弱毒株。野毒株群G2 包含2 個(gè)分枝,以韓國(guó)野毒株和中國(guó)野毒株為代表的2-1,和以山東毒株與華南毒株為代表的2-2。本試驗(yàn)分離的22 株野毒株與5 株韓國(guó)流行株和3 株中國(guó)流行株聚類(lèi)于2-1 分支中,拓?fù)鋱D顯示,該分支病毒是由韓國(guó)經(jīng)典毒株Virulent DR13 變異而來(lái)。其余6 個(gè)山東省流行毒株與2011 -2012 年分離得到的5 個(gè)廣東野毒株和1 個(gè)福建野毒株聚類(lèi)在一起,拓?fù)鋱D顯示,該分支的山東省流行病毒株和廣東省流行病毒株與福建省的P9 病毒株起源于共同的祖先。

表2 參考序列信息

3 討論

PEDV 屬于尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus),是有囊膜的不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒[4-5]。多項(xiàng)研究證實(shí),PEDV 毒株目前只存在1 種血清型[6]。自PEDV 流行以來(lái),成為造成仔豬腹瀉死亡的主要原因[7],即使在免疫豬場(chǎng),感染該病毒的仔豬死亡率高達(dá)100%[8],給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)對(duì)山東省13 地市發(fā)生腹瀉的豬進(jìn)行臨床診斷和PCR 技術(shù)相結(jié)合,確定2017 -2018 年P(guān)EDV 在山東的流行情況。

圖2 PEDV ORF3 遺傳進(jìn)化分析

PEDV 病毒目前分為3 個(gè)基因型:經(jīng)典型、弱毒型和流行型[9]。其ORF3 基因在病毒進(jìn)化史上相對(duì)保守,但不同流行地區(qū)野毒株的ORF3 基因也存在一定的特異性差異,因此開(kāi)展ORF3 基因的分子流行病學(xué)調(diào)查,對(duì)于PEDV 的區(qū)域性防控具有重要意義。本試驗(yàn)獲得的28 株野毒株P(guān)EDVORF3 基因測(cè)序結(jié)果顯示,ORF3 基因只存在個(gè)別位點(diǎn)的突變,沒(méi)有發(fā)生缺失和插入,大小均為675 bp,編碼224 個(gè)氨基酸。遺傳分析顯示,2 -1 分支與經(jīng)典毒株CV777和LZC 親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但與韓國(guó)毒株親緣關(guān)系較近,病毒是否由韓國(guó)流入還需進(jìn)一步證實(shí)。雖然進(jìn)化樹(shù)拓?fù)鋱D顯示,山東和廣東的流行毒株與福建P9具有相同的進(jìn)化地位,但2-2 分支毒株最早出現(xiàn)在中國(guó)廣東[10-11],并在華南個(gè)別省份持續(xù)存在2 年左右。這一類(lèi)型PEDV 流行株具有強(qiáng)致病性,引起仔豬100% 高死亡率。2015 年在山東省被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)[12],直到現(xiàn)在該分支病毒仍在山東境內(nèi)流行,其他地區(qū)再無(wú)報(bào)道。

由此我們得出2 點(diǎn)推論:推論1,是否2-1 亞型分支是由2-2 分支病毒變異而來(lái)? 2-1 與2-2 分支比較來(lái)看,2-2 分支的進(jìn)化地位較2-1 靠前,病毒序列比較保守,沒(méi)有引起大規(guī)模疫病的流行,只是散狀零星發(fā)生。推論2,2-2 亞型是否適合做我國(guó)PEDV疫苗的備選毒株? 除了廣東、湖北、福建和山東四省檢測(cè)到該亞型的病毒,其他地區(qū)包括國(guó)外均無(wú)報(bào)道,且從2013 年以來(lái),華南沒(méi)有再發(fā)生該亞型引起的家畜PEDV 感染事件。畢竟地域不臨近,我們無(wú)法推測(cè)山東省檢測(cè)到的2-2 亞型是從華南流入本地,但是該亞型毒株流行較慢,序列較保守,是否適合研發(fā)成新的PEDV 疫苗株還需進(jìn)一步理論和試驗(yàn)驗(yàn)證。山東省是農(nóng)畜產(chǎn)品生產(chǎn)和交易大省,大量的畜產(chǎn)品交易再加上交通運(yùn)輸環(huán)節(jié)的防護(hù)和消毒的不到位,給疫病防控增加了重重困難。總之,這種現(xiàn)象警示我們應(yīng)注意這一基因型病毒的流行和變異情況,預(yù)防該基因型PEDV 的大規(guī)模暴發(fā)。