李佳帥，楊再?gòu)?qiáng),2**，王明田，韋婷婷，趙和麗，江夢(mèng)圓，孫 擎，黃琴琴

?

水氮耦合對(duì)苗期葡萄葉片氮素代謝酶活性的影響*

李佳帥1，楊再?gòu)?qiáng)1,2**，王明田3，韋婷婷1，趙和麗1，江夢(mèng)圓1，孫 擎1，黃琴琴1

（1．南京信息工程大學(xué)氣象災(zāi)害預(yù)報(bào)預(yù)警與評(píng)估協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210044；2．江蘇省農(nóng)業(yè)氣象重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210044；3．四川省氣象局，成都 610071）

為研究水氮耦合對(duì)苗期葡萄葉片氮代謝影響及最佳施氮量的制定，以一年生葡萄品種紅提為研究試材，利用人工控制環(huán)境的方法，在溫室內(nèi)采用水、氮兩因素各4水平的全面設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，水分處理分別為正常灌溉W1（田間最大持水量的70%～80%）、輕度脅迫W2（60%～70%）、中度脅迫W3（50%～60%）和重度脅迫W4（30%～40%）。4個(gè)氮素施用水平分別為1.5倍推薦施肥N1（施純氮25.5g·m?2）、正常推薦施肥N2（17g·m?2）、0.5倍推薦施肥N3（8.5g·m?2）、不施用氮肥N4（不施氮）。處理時(shí)間為10、20、30、40d。結(jié)果表明，在水分條件適宜時(shí)，葡萄葉片硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）活性、可溶性蛋白、游離氨基酸含量隨施氮量增加而提高；在輕度干旱脅迫時(shí)，增施氮肥可緩解干旱脅迫；在重度干旱脅迫時(shí)，高氮處理使設(shè)施葡萄葉片中氮代謝酶活性、游離氨基酸和可溶性蛋白含量降低。葡萄葉片內(nèi)氮含量始終隨處理時(shí)間增加而降低，在輕度水分脅迫下氮的轉(zhuǎn)運(yùn)率較高，而水分脅迫嚴(yán)重時(shí)，高氮處理與無(wú)氮處理時(shí)氮轉(zhuǎn)運(yùn)率均偏低。最終得出：在水分條件適宜（W1）和輕度水分脅迫（W2）下，N1處理葡萄葉片的氮代謝能力最高；在中度水分脅迫（W3）和重度水分脅迫（W4）下，N3、N4處理氮代謝能力最高。研究結(jié)果可為實(shí)際生產(chǎn)中設(shè)施葡萄的干旱災(zāi)害防控提供理論依據(jù)，既能有效緩解水分脅迫帶來(lái)的危害，又避免生產(chǎn)中肥料的浪費(fèi)。

葡萄；氮代謝酶；水氮脅迫；氮含量；最佳施氮量

葡萄（）屬落葉多年生藤本植物，在全球果品生產(chǎn)中，其產(chǎn)量及栽培面積均居首位。葡萄富含營(yíng)養(yǎng)、口味佳、用途廣，因此經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。隨著市場(chǎng)需求逐漸加大，栽培面積也逐漸增加，截至2014年，中國(guó)葡萄栽培總面積超過(guò)80萬(wàn)hm2，設(shè)施葡萄栽培面積13.3萬(wàn)hm2，居世界第一[1]。江蘇省葡萄種植面積近4萬(wàn)hm2，以鮮食葡萄為主[2]。近年來(lái)，水分虧缺給秋冬季溫室葡萄基肥的管理工作造成一定困擾，其中氮素是葡萄生長(zhǎng)發(fā)育中重要元素之一，施氮量將直接影響植株氮代謝活動(dòng)，從而影響葡萄的品質(zhì)及產(chǎn)量。氮代謝是植物生長(zhǎng)發(fā)育中重要生理代謝過(guò)程之一[3]，正常環(huán)境條件下，外來(lái)的NO3?-N進(jìn)入細(xì)胞后，首先在位于細(xì)胞質(zhì)中的硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）的作用下還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽再進(jìn)一步還原成 NH4+。NR作為植物NO3?同化的第一個(gè)關(guān)鍵性誘導(dǎo)酶，同時(shí)也是硝酸鹽同化的限速酶，其活性高低直接影響介質(zhì)中NO3?的利用，且包括氨基酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成[4]。Andrews等[5]研究發(fā)現(xiàn)，NR活性對(duì)環(huán)境敏感，隨施氮水平提高而提高。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）/谷氨酸合成酶（glutamine-α-oxoglutarate aminotransferase，GOGAT）途徑是高等植物同化銨態(tài)氮（NH4+）的主要途徑[6?7]，進(jìn)入植物體的NH4+-N在GS、GOGAT作用下被迅速同化為氨基酸和蛋白質(zhì)，以降低NH4+-N在細(xì)胞組織中的含量，減少毒害[8]，其兩者是植物體內(nèi)游離氨基酸和可溶性蛋白等大分子合成的主要供體[9?10]。張華珍等[11?12]也研究表明GS、GOGAT有協(xié)同作用。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就不同水、氮水平對(duì)氮代謝酶活性的影響作了相關(guān)研究。于坤等[13]研究表明，水分適宜時(shí)增加施氮可提高葡萄幼苗葉片氮含量并保持葉片NR、GS的高活性；張麗瑩等[14]對(duì)黃瓜葉片研究發(fā)現(xiàn)，在低肥水平下較低的灌水量會(huì)提高葉片中NR、GS活性，而在中肥和高肥水平下中等灌水量最有利于NR、GS活性的提高。張智猛等[15]研究花生葉片發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高氮素水平既能增加花生葉片中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量，又能提高NR、GOGAT等氮素同化酶的活性，使其同步增加，然而施氮量過(guò)高雖能提高NR、可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸的含量，但GS活性下降；王月福等[16]研究冬小麥旗葉提出，適當(dāng)增施氮肥能提高NR和GS活性，且葉片可溶性蛋白含量也表現(xiàn)出相似的變化；趙宏偉等[17]研究表明，春玉米穗位葉片NR、GS活性隨施氮水平升高有明顯增加，而葉片可溶性蛋白含量受氮素水平影響較??；岳紅賓等[18]研究發(fā)現(xiàn)，煙草葉片提高氮素水平時(shí)NR活性升高。以往研究多為氮肥對(duì)葡萄生理生態(tài)、生物學(xué)特性的報(bào)道，而有關(guān)葡萄幼苗期不同水、氮處理對(duì)葉片氮含量、氮轉(zhuǎn)運(yùn)率及氮素代謝的系統(tǒng)研究報(bào)道較少。本研究針對(duì)水氮耦合對(duì)葡萄葉片氮代謝的影響開展實(shí)驗(yàn)，旨在初步得出不同水分條件下的最佳施氮量，以期為葡萄的優(yōu)培和合理水肥運(yùn)籌提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)于2017年9?12月在南京信息工程大學(xué)農(nóng)試站Venlo型實(shí)驗(yàn)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行（N32°12′19.48″，E118°42′36.11″），地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，溫室頂高5.0m，肩高4.5m，寬9.6m，長(zhǎng)30.0m，南北走向。以一年生葡萄苗紅提為試材。供試土壤為中壤土，pH7.4，有機(jī)質(zhì)含量18.32g·kg?1，全氮0.86g·kg?1，全磷0.75g·kg?1，田間持水量32.45%。

待植株葉片超過(guò)15葉后定植于4個(gè)長(zhǎng)8m、寬1m、深1m的水泥池苗床內(nèi)，開始灌水量和施氮量?jī)梢蛩貙?shí)驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平，每個(gè)水泥池苗床內(nèi)為同一水分處理，處理間不存在側(cè)漏，灌溉方式為澆灌，通過(guò)EM50（DecagonDevice.USA）采集土壤深度30cm處水分?jǐn)?shù)據(jù)，獲得每小時(shí)土壤水分?jǐn)?shù)據(jù)，4個(gè)水分處理梯度[19]分別為，正常灌溉W1（田間最大持水量的70%～80%）、輕度脅迫W2（田間最大持水量的60%～70%）、中度脅迫W3（田間最大持水量的50%～60%）、重度脅迫W4（田間最大持水量的30%～40%）。利用PE塑料薄膜將每個(gè)水泥池分成4個(gè)區(qū)域，設(shè)置4個(gè)施氮梯度。查閱文獻(xiàn)并計(jì)算得出，葡萄生長(zhǎng)初期的推薦施氮量[20?21]為純氮17g·m?2，因此，試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)氮素指標(biāo)分別為，1.5倍推薦施肥（N1）；正常推薦施肥（N2）；0.5倍推薦施肥（N3）；不施用氮肥（N4）。對(duì)水、氮兩因素進(jìn)行全面設(shè)計(jì)，共16個(gè)處理如表1所示，葉片鮮樣采集在9：00?11：00進(jìn)行，共取4次。當(dāng)天樣品用液氮速凍，并集于?20℃冰箱中備用，采樣完畢后，統(tǒng)一測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)期間，除控制變量外，其它管理措施正常。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 1 Experimental design

1.2 測(cè)量項(xiàng)目與方法

1.2.1 溫室小氣候數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)期間溫室內(nèi)平均氣溫為15.6℃，日最高氣溫27.3℃，最低氣溫8℃。實(shí)驗(yàn)正值秋冬季，日平均氣溫呈下降趨勢(shì)。溫室內(nèi)平均空氣相對(duì)濕度為81%，最高為96%，最低為54%，呈波動(dòng)變化。平均日光合有效輻射累計(jì)值為5.02MJ·m?2，最高為6.91MJ·m?2，最低為3.94MJ·m?2，期間溫室內(nèi)光合有效輻射值變化平穩(wěn)。期間土壤水分雖有波動(dòng)，但均在各水分梯度范圍內(nèi)。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

（1）氮含量

將采集的植株葉片鮮樣烘干至恒重，粉碎后用H2SO4?H2O2消化，最后用凱氏法蒸餾測(cè)定全氮含量（g·kg?1）[22]。

（2）氮轉(zhuǎn)運(yùn)率

氮轉(zhuǎn)運(yùn)率指氮轉(zhuǎn)運(yùn)量占起始植株葉片氮含量的百分比。

式中，W表示氮轉(zhuǎn)運(yùn)率（%），C0表示第一次即處理第10天所取樣品中的氮含量（g·kg?1），C1表示最后一次即處理第40天所取樣品中的氮含量（g·kg?1）。

（3）可溶性蛋白含量

采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定[23]

式中，Spc為可溶性蛋白含量（mg·g?1），C為標(biāo)準(zhǔn)曲線值（g），VT為提取液總體積（mL），WF為樣品鮮重（g），VS為測(cè)量時(shí)加樣量（mL）。

（4）硝酸還原酶活性（NR，mg·g?1·h?1）

采用離體法[24]測(cè)定，即

式中，x為反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量（mg），V1為提取酶時(shí)加入的緩沖液體積（mL），V2為酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積（mL），W為樣品鮮重（g），t為反應(yīng)時(shí)間（h）。

（5）谷氨酰胺合成酶活性（GS）

取鮮樣1g，加3mL提取緩沖液（pH8.0，內(nèi)含0.05mol·L?1Tris-HCl，2mmol·L?1Mg2+，2mmol·L?1DTT，0.4mol·L?1蔗糖），冰浴研磨至勻漿，4℃下15000g離心20min，上清液即為酶粗提液。接著進(jìn)行顯色反應(yīng)，1.6mL反應(yīng)混合液B（0.1mol·L?1Tris-HCl緩沖，pH7.4，內(nèi)含80mmol·L?1Mg2+，20mmol·L?1谷氨酸鈉鹽，2mmol·L?1半胱氨酸和2mmol·L?1EGTA，再加入80mmol·L?1鹽酸羥胺），加入0.7m粗酶液和0.7mLATP溶液，混勻，于37℃下保溫30min，加入顯色劑1mL（0.2mol·L?1TCA，0.37mol·L?1FeCl3和0.6mol·L?1HCl混合液），搖勻并放置片刻后，于5000g下離心10min，取上清液測(cè)定540nm處的吸光值。

式中，GS活性單位為A·mg?1protein·h?1，A為540nm處的吸光值，P為粗酶液中的可溶性蛋白含量，V為反應(yīng)體系中加入的粗酶液體積，t為反應(yīng)時(shí)間。

（6）谷氨酸合成酶活性（GOGAT）

提取液同GS，反應(yīng)混合液包括20mmol·L?1的L-谷氨酰胺0.4mL，20mmol·L?1的α-酮戊二酸0.5mL，10mmol·L?1的KCL 0.1mL，30mmol·L?1的NADH 0.2mL和0.3mL酶液，總體積3mL，不足部分用pH7.6濃度為0.05mol·L?1的Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足（1.5mL），反應(yīng)啟動(dòng)后，用紫外分光光度計(jì)于340nm處每30s測(cè)定一個(gè)消光值，連續(xù)測(cè)定11次，取光密度最穩(wěn)定減少的一段來(lái)衡量酶活性，一個(gè)GOGAT活性單位定義為在該反應(yīng)條件下，每分鐘反應(yīng)混合液減少1μmolNADH為一個(gè)活性單位。

式中，GOGAT活性單位為μmol·g?1·min?1，ΔA是穩(wěn)定減少的那段吸光度，V1表示上清液總體積，WF表示樣品重量，t表示酶反應(yīng)時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel2013、SPSS16.0軟件進(jìn)行制圖與分析，用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水氮耦合處理對(duì)葡萄葉片氮含量的影響

由圖1可見，土壤濕度對(duì)葡萄植株葉片氮含量有明顯影響，土壤濕度越小葉片吸收的氮也越少，正常供水情況下（W1，70%～80%）葉片氮含量整體水平較高（3.89～8.61g·kg?1），隨著土壤濕度的降低，W2（60%～70%）、W3（50%～60%）處理中植株葉片氮含量分別降至1.77～7.90g·kg?1、2.48～6.98g·kg?1水平，在嚴(yán)重缺水情況下（W4，30%～40%），葉片氮含量?jī)H達(dá)1.76～3.50g·kg?1，顯著低于其它灌水處理（P＜0.05）。同時(shí)，在正常供水情況下，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，植株葉片氮含量呈降低趨勢(shì)（圖1a），處理時(shí)間越長(zhǎng)差異越大，但在相對(duì)缺水情況下，這種降低趨勢(shì)逐漸消失，植株葉片氮含量均處于較低水平（圖1d）。

圖1顯示，土壤中施氮與不施氮肥對(duì)葡萄植株葉片氮含量也有顯著影響，在相同的供水情況下，施氮處理（N1、N2、N3）中植株葉片氮含量均顯著高于不施氮處理（N4），而不同施氮水平間葉片氮含量的差異表現(xiàn)為早期（10d、20d）不顯著，后期（30d、40d）相對(duì)較顯著，W2處理中差異顯著，其它處理中相對(duì)不顯著。說(shuō)明植物葉片氮含量取決于水氮耦合作用，在水分供應(yīng)充足時(shí)植株葉片對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)吸收能力強(qiáng)，其氮含量相對(duì)較高，在干旱條件下，葡萄植株受水分制約導(dǎo)致氮吸收能力降低，從而植株葉片氮含量下降，在相同的水分條件下，施氮多的植株葉片內(nèi)含氮量高于施氮少的植株，并隨處理時(shí)間增加葉片含氮量整體呈減少趨勢(shì)。

2.2 水氮耦合對(duì)葡萄葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)率的影響

葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)率指觀測(cè)期間氮轉(zhuǎn)運(yùn)量（氮含量減少值）占初次觀測(cè)時(shí)葉片氮含量的百分比。由表2可見，在正常水分處理（W1）下氮轉(zhuǎn)運(yùn)率最高為N3處理的29.21%，比N4、N1、N2處理分別高1.22個(gè)、1.75個(gè)、1.8個(gè)百分點(diǎn)，在輕度（W2）和中度（W3）水分脅迫下，氮轉(zhuǎn)移率大小表現(xiàn)為N4>N3>N2>N1，重度水分脅迫（W4）下氮轉(zhuǎn)移率最高的為N3處理，N1處理最低，兩者相差14.4個(gè)百分點(diǎn)。整體而言，在輕度水分脅迫下氮的轉(zhuǎn)運(yùn)率偏高，說(shuō)明葡萄植株具有一定抗旱性，而水分嚴(yán)重虧缺甚至影響植物體正常生長(zhǎng)時(shí)，高氮處理與無(wú)氮處理的氮轉(zhuǎn)運(yùn)率均偏低。

圖1 不同土壤含水量條件下各施氮處理葡萄葉片氮含量的比較

注：W1、W2、W3和W4分別表示田間最大持水量的70%～80%、60%～70%、50%～60%和30%～40%水分處理。小寫字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性。短線表示均方誤。下同。

Note : W1, W2, W3 and W4 is 70%?80%, 60%?70%, 50%?60% and 30%?40% of maximum water capacity in the field, respectively. Lowercase indicates the difference significance among treatments at 0.05 level. The short bar is mean square error. The same as below.

表2 不同水氮處理下葡萄葉片氮轉(zhuǎn)運(yùn)率的比較（%）

2.3 水氮耦合對(duì)葡萄葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是植物體內(nèi)可溶于水的小分子蛋白質(zhì)，其含量越高說(shuō)明植物氮代謝水平高。由圖2a可見，在正常水分含量W1下，N1、N2處理表現(xiàn)出葉片可溶性蛋白含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而增大，但N3、N4在處理30d后有略微降低趨勢(shì)，從整體看，可溶性蛋白含量最多的為高氮處理（N1），最大值出現(xiàn)在處理40d時(shí)，為14.47mg·g?1，最少的是無(wú)氮的N4處理。在輕度干旱處理（圖2b）中，進(jìn)行N2處理的葡萄葉片可溶性蛋白含量最高，其后依次是N1、N3、N4處理，但仍分別比正常水分處理時(shí)減少了13.20%、3.10%、1.54%、4.44%。在中度干旱處理（圖2c）中，各氮素水平表現(xiàn)出的可溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)一致，均為先增長(zhǎng)后降低，其中值得注意的是，N4在處理40d時(shí)其值最低。重度干旱脅迫下（圖2d），可溶性蛋白含量最高的為N4處理，其后依次是N3、N2、N1處理，N1處理在40d時(shí)基本處于蔫死狀態(tài)，較W1處理下N1、N2、N3、N4均值分別降低71.6%、61.3%、53.0%、43.3%?？傊叩谝欢ǔ潭壬峡蓮浹a(bǔ)水分虧缺，但隨著水分脅迫加重增加氮素非但對(duì)植株生長(zhǎng)沒(méi)有幫助，反而使植物所受脅迫更加嚴(yán)重，由圖2可得，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N2、N3和N4處理。

圖2 不同水氮處理下葡萄葉片可溶性蛋白含量的比較

2.4 水氮耦合對(duì)葡萄葉片游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸是氮代謝的中間產(chǎn)物，它能夠影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和氮同化，其含量多反映了氮代謝能力強(qiáng)，反之則表示弱。由圖3看出，葉片游離氨基酸含量隨處理天數(shù)增加呈現(xiàn)不同程度的變化趨勢(shì)（P<0.05），其中圖3a中N1處理游離氨基酸含量最高，較N2、N3、N4處理分別高出8.71%、25.25%、46.72%；由圖3b可得，在處理10d時(shí)，游離氨基酸分布表現(xiàn)為N2>N1>N3>N4，隨著處理時(shí)間的增加，4種氮處理下的游離氨基酸含量逐漸增加，在處理40d時(shí)，游離氨基酸分布表現(xiàn)為N1>N2>N3>N4，說(shuō)明葡萄在生長(zhǎng)過(guò)程中有一定抗旱性；由圖3c、3d發(fā)現(xiàn)，在W3、W4水分處理下的游離氨基酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且N3和N4處理下的游離氨基酸含量顯著高于N1和N2處理。說(shuō)明在水分適宜（W1）和輕度水分脅迫（W2）下，增加施氮量使游離氨基酸含量增加，中度水分脅迫（W3）下，低氮處理更能緩解水分脅迫帶來(lái)的危害，重度水分脅迫（W4）下，氮處理不能緩解水分脅迫的危害，而會(huì)造成更嚴(yán)重的后果，由圖3可得，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N1、N3和N4處理。

2.5 水氮耦合對(duì)葡萄葉片硝酸還原酶活性的影響

葡萄葉片在生育期吸收的氮素主要形式是硝態(tài)氮，但參與氨基酸和蛋白質(zhì)合成還需在硝酸還原酶（NR）催化作用下還原成銨態(tài)氮。NR是植物體內(nèi)硝態(tài)氮同化的調(diào)節(jié)酶和限速酶，因此它對(duì)外界氮肥反應(yīng)敏感。圖4a是正常水分處理（W1）下的情況，由圖可見，NR活性以高氮處理（N1）最高，高出N2處理15.80%，以低氮N4處理最低，較N2減少了26.55%，N1、N2、N3處理的NR活性整體隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，而N4呈先略微增大后減少的趨勢(shì)；圖4b中各處理的變化規(guī)律與圖4a基本一致，但斜率有顯著降低；圖4c中N1處理下的NR活性顯著降低，最高的是N3處理，仍較W1N2低10%，其次是N2處理，N1與N4差別不大；由圖4d可見，在處理40d后，N4中NR活性最高，最低的反而是N1處理。說(shuō)明在不同水分條件下一定范圍內(nèi)提高施氮水平可促進(jìn)葉片NR活性，而施氮過(guò)量會(huì)造成氮素營(yíng)養(yǎng)供過(guò)于求，NR增幅降低，甚至不增加反而減少，由圖4可得，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N1、N3和N4處理。

圖3 不同水氮處理下葡萄葉片游離氨基酸含量的比較

圖4 不同水氮處理下葡萄葉片硝酸還原酶活性的比較

2.6 水氮耦合對(duì)葡萄葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響

谷氨酰胺合成酶（GS）具有將NH4+代謝從無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的中心作用，是參與氨同化過(guò)程的關(guān)鍵酶。從圖5a可以看出，正常水分處理（W1）條件下，N1、N2處理GS活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而N3、N4呈先增加后減少趨勢(shì)，在處理30d時(shí)達(dá)峰值，分別為0.27、0.23A·mg?1protein·h?1；圖5b可見，在輕度干旱（W2）下，N2處理中GS的活性較N1處理高9.21%，N3、N4處理GS活性隨著脅迫時(shí)間呈先增大后減少的趨勢(shì)，圖c、圖d分別是中度和重度水分脅迫，GS活性均隨脅迫時(shí)間增加先略微增加后降低，中度水分處理下N3表現(xiàn)最好，而重度水分脅迫下則是N4，說(shuō)明在低灌溉量水平下低肥有助于植株NR活性的提高，肥料充足低灌水量反而抑制其活性。整體表明輕度水分脅迫（W2）對(duì)植株葉片GS活性影響較小，維持了正常植株氨同化過(guò)程；中度（W3）和重度（W4）水分脅迫下GS活性顯著低于W1、W2處理下，由于水分缺乏降低了植株氮同化能力，大量銨態(tài)氮的積累，影響植株生長(zhǎng)。由圖5可見，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N2、N3和N4處理。

圖5 不同水氮處理下葡萄葉片谷氨酰胺合成酶活性的比較

2.7 水氮耦合對(duì)葡萄葉片谷氨酸合成酶活性的影響

谷氨酸合成酶（GOGAT）是生成谷氨酸的催化酶，與GS構(gòu)成的循環(huán)反應(yīng)是高等植物氨同化的主要途徑。由圖6可看出，正常水分處理（W1）下葉片谷氨酸合成酶活性顯著高于其它水分脅迫處理，即W1>W2>W3>W4，其中圖6a中N1處理表現(xiàn)出的GOGAT活性最高，其曲線斜率表現(xiàn)出增長(zhǎng)速率最快；由圖6b得，輕度水分脅迫（W2）條件下各處理均在脅迫30d時(shí)出現(xiàn)峰值，分別為0.45、0.49、0.43、0.41μmol·g?1·min?1，由圖6c可看出，在中度水分脅迫條件（W3）下，GOGAT活性最高的是N3處理，N1、N2、N4較N3分別低22.18%、20.01%、19.81%；由圖6d可以看出，在嚴(yán)重水分脅迫（W4）下，N1、N2、N3、N4表現(xiàn)出的GOGAT活性較低，從均值上看N4>N3>N2>N1，說(shuō)明在水分嚴(yán)重缺乏的條件下并不適宜用施氮來(lái)緩解。由圖6可見，W1、W2、W3和W4水分條件下的最佳施氮量分別是N1、N2、N3和N4處理。

圖6 不同水氮處理下葡萄葉片谷氨酸合成酶活性的比較

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，葡萄葉片中氮含量隨水分脅迫程度加重而減少，在相同水分條件下，一方面植株葉片氮含量隨處理時(shí)間增加呈減小趨勢(shì)，這是一種稀釋現(xiàn)象。另一方面，植株內(nèi)氮含量隨施氮量增加而增加，說(shuō)明施氮可增加植株對(duì)氮的吸收，但水分虧缺則抑制植物對(duì)氮的吸收。這與向友珍等[25]對(duì)不同水氮處理下甜椒葉片氮含量的規(guī)律一致，原因是水分虧缺使氮素運(yùn)輸受到影響，甚至無(wú)法滿足植株正常生長(zhǎng)需求。就氮轉(zhuǎn)運(yùn)率而言，輕度水分脅迫下氮轉(zhuǎn)運(yùn)率最高，說(shuō)明適度干旱更有利于葡萄植株葉片的氮轉(zhuǎn)運(yùn)。

在調(diào)節(jié)氮代謝過(guò)程中，硝酸還原酶（NR）是作物吸收利用NO3?過(guò)程中首個(gè)關(guān)鍵酶，直接調(diào)節(jié)NO3?的還原；谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）構(gòu)成的循環(huán)是NH4+同化的主要途徑。NR、GS、GOGAT是高等植物氮吸收、同化和循環(huán)的主要酶系。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄幼苗葉片NR活性在輕度水分脅迫下有一定提高，這與孫園園等[26]對(duì)水稻的研究結(jié)果一致，說(shuō)明葡萄具有一定抗旱性，在持續(xù)中度和重度水分脅迫下，NR活性呈顯著降低，且峰值隨著水分脅迫程度加重而不斷提前，這與楊夕等[27]的研究結(jié)果一致，因?yàn)镹R是氮代謝過(guò)程中的第一個(gè)酶，對(duì)水分變化極其敏感，水分脅迫使葉片NR活性得到快速響應(yīng)；GS、GOGAT活性隨水分脅迫加重呈不同程度降低，因水分作為吸收和運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)的主要媒介，它的虧缺使進(jìn)入葡萄植株內(nèi)的NO3?-N和NH4+-N減少，隨之氮代謝受到影響，相應(yīng)的GS和GOGAT活性也大幅降低，這與白澤晨等[28]的研究結(jié)果一致，但周衛(wèi)等[29]在對(duì)水稻幼苗研究時(shí)發(fā)現(xiàn)輕度水分脅迫不影響植株內(nèi)氨代謝，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不符，可能原因一是不同研究對(duì)象抗旱性不同，二是實(shí)驗(yàn)設(shè)置的水分脅迫程度不同，使結(jié)果帶來(lái)一定偏差，在重度水分脅迫下水稻幼苗的GS、GOGAT活性受到顯著影響與本研究結(jié)果一致。在水分適宜條件下，缺少氮肥嚴(yán)重抑制NR、GS、GOGAT活性，一定范圍內(nèi)提高施氮水平可促進(jìn)葡萄葉片內(nèi)氮代謝，而在干旱情況下施氮過(guò)量會(huì)造成氮素營(yíng)養(yǎng)供過(guò)于求，使NR、GS、GOGAT活性增加幅度降低，甚至減少，此時(shí)反而低氮處理更適宜葡萄植株的生長(zhǎng)，這與張麗瑩等[14]對(duì)黃瓜葉片的研究一致。由此推測(cè)，水分適宜時(shí)增施氮肥使后期土壤中氮素含量仍較高，植物體能夠繼續(xù)吸收土壤中的氮素，進(jìn)而有較強(qiáng)的氮素同化和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，因此，有利于延緩葉片衰老，為蛋白質(zhì)、氨基酸等的積累奠定良好基礎(chǔ)。

游離氨基酸作為氮代謝的中間產(chǎn)物，可溶性蛋白質(zhì)作為氮代謝的最終產(chǎn)物，它們的合成均在NR、GS、GOGAT等酶的共同催化下完成。可溶性蛋白質(zhì)含量在一定程度上反應(yīng)了氮代謝的活躍程度，也是體現(xiàn)植株葉片衰老的關(guān)鍵指標(biāo)，而游離氨基酸是植株體內(nèi)氮化物的主要存在和運(yùn)輸形式，它參與氮素的吸收和同化，并與器官中蛋白質(zhì)的合成和降解緊密聯(lián)系在一起。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，增施氮肥可顯著提高小麥、水稻、玉米等植株葉片中游離氨基酸含量，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。本實(shí)驗(yàn)研究表明，隨處理時(shí)間遞增，葡萄葉片游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量在W1和W2條件下大體呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，并且高氮處理有利于兩者在葡萄葉片中的積累，在W3和W4條件下，高氮處理不但不能提高游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量反而使其值顯著降低，所受危害更嚴(yán)重，這可能與氮肥含量過(guò)高，引起氮素在組織內(nèi)大量積累，造成植株源器官中氮代謝能力受限，以及葉片中NR、GS和GOGAT等酶活性的降低導(dǎo)致氮同化和合成能力下降有關(guān)，這在前人研究中得到了證實(shí)。由此進(jìn)一步說(shuō)明，葉片中游離氨基酸和可溶性蛋白含量能很好地表征氮素同化和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

3.2 結(jié)論

在適宜水分條件下增施氮肥葡萄葉片氮代謝增強(qiáng)，為葡萄生育后期物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)奠定了良好基礎(chǔ)；植株遭遇輕度水分脅迫時(shí)，增施氮肥在一定程度上能減輕干旱帶來(lái)的脅迫。在水分嚴(yán)重虧缺條件下，減少施氮更有利于植株生長(zhǎng)。研究對(duì)設(shè)施葡萄實(shí)際生產(chǎn)中的推薦施氮量進(jìn)行綜合評(píng)估認(rèn)為，在輕度水分脅迫（W2）下，施用N1（25.5g·m?2）能有效緩解干旱帶來(lái)的危害；在中度水分脅迫（W3）下，施用N3（8.5g·m?2）較好；在重度水分脅迫（W4）下，施氮處理已不能緩解干旱帶來(lái)的危害。按照以上施肥方案進(jìn)行實(shí)際操作，既能有效利用氮肥來(lái)緩解干旱脅迫，也能有效避免肥料的浪費(fèi)，實(shí)現(xiàn)低投入，高產(chǎn)出，給實(shí)際生產(chǎn)提供重要指導(dǎo)。但本實(shí)驗(yàn)只就氮素水平做了一定研究，而未將氮素形態(tài)以及與其它肥料配施對(duì)氮代謝酶相關(guān)影響考慮其中，針對(duì)氮磷鉀肥影響下的葡萄植株生理響應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 穆維松,高陽(yáng),王秀娟,等.我國(guó)設(shè)施葡萄生產(chǎn)的成本收益比較研究[J].中外葡萄與葡萄酒,2014,(3):20-24.

Mu W S,Gao Y,Wang X J,et al.Comparative cost-benefit analysis on grape protected cultivation[J].Chinese and Foreign Grapes and Wine,2014,(3):20-24.(in Chinese)

[2] 吉沐祥,李國(guó)平,芮東明,等.江蘇省鮮食葡萄病蟲害綠色防控技術(shù)規(guī)程[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(7):107-109.

Ji M X,Li G P,Rui D M,et al.Technical specification for green control of diseases and insect pests of fresh grapevine in Jiangsu province[J].Jiangsu Agricultural Science,2015,43(7):107-109.(in Chinese)

[3] 張毅,石玉,胡曉輝,等.外源Spd對(duì)鹽堿脅迫下番茄幼苗氮代謝及主要礦質(zhì)元素含量的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2013,24(5):1401-1408.

Zhang Y,Shi Y,Hu X H,et al.Effects of exogenous Spd on nitrogen metabolism and contents of main mineral elements in tomato seedlings under salt and alkali stress[J].Journal of Applied Ecology,2013,24(5):1401-1408.(in Chinese)

[4] 谷端銀,王秀峰,高俊杰,等.純化腐植酸對(duì)氮脅迫下黃瓜幼苗生長(zhǎng)和氮代謝的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2018,29(8):2575-2582.

Gu D Y,Wang X F,Gao J J,et al.Effects of purified humic acid on the growth and nitrogen metabolism of cucumber seedlings under nitrogen stress[J].Journal of Applied Ecology,2018, 29(8):2575-2582.(in Chinese)

[5] Andrews M,Raven JA,Lea PJ.Do plants need nitrate?The mechanisms by which nitrogen form affects plants[J].Annals of Applied Biology,2013,163:174-199.

[6] Gajewska E,Sklodowska M.Nickel-induced changes in nitrogen metabolism in wheat shoots[J].Journal of Plant Physiology, 2009,166:1034-1044.

[7] Lam H M,Coschigano K T,Oliveira I C,et al.The molecular- genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants[J].Annual Review of Plant Biology,1996,47:569-593.

[8] Vega M,Marinod,Sanchez Z,et al.CO2enrichment modulates ammonium nutrition in tomato adjusting carbon and nitrogen metabolism to stomatal conductance[J].Plant Sci,2015,41:32-44.

[9] 丁邦琴,李鐵軍.谷氨酰胺高產(chǎn)菌株在不同NH4+濃度下的基因差異表達(dá)[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2013,32(1):41-45.

Ding B Q,Li T J.Differential gene expression of high glutamine producing strain of arthrobact globiformis in the different NH4+concentration[J].Genomics and Applied Biology, 2013,32(1):41-45.(in Chinese)

[10] Krapp A.Plant nitrogen assimilation and its regulation:a complex puzzle with missing pieces[J].Current Opinion in Plant Biology,2015,25:115-122.

[11]張華珍,徐恒玉.植物氮素同化過(guò)程中相關(guān)酶的研究進(jìn)展[J].北方園藝,2011,(20):180-183.

Zhang H Z,Xu H Y.Advances in the study of enzymes related to nitrogen assimilation in plants[J].Northern Horticulture,2011,(20):180-183.(in Chinese)

[12]孫永健,孫園園,蔣明金,等.施肥水平對(duì)不同氮效率水稻氮素利用特征及產(chǎn)量的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,49(24):4745-4756.

Sun Y J,Sun Y Y,Jiang M J,et al.Effects of fertilizer levels on nitrogen utilization characteristics and yield in rice cultivars with different nitrogen use efficiencies[J].Scientia Agricultura Sinica,2016,49(24):4745-4756.(in Chinese)

[13]于坤.滴灌方式和水氮處理對(duì)釀酒葡萄幼苗生理特性和根系形態(tài)的影響[D].石河子:石河子大學(xué),2014.

Yu K.Effects of irrigation methods and water and nitrogen application on root morphology and physiological characteristics of wine grapes seedlings[D].Shihezi:Shihezi University,2014.(in Chinese)

[14]張麗瑩.水肥耦合對(duì)溫室無(wú)土栽培水果黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其生理機(jī)制的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

Zhang L Y.Effects of water and fertilizer coupling on growth and development of fruit cucumber and its physiological mechanism under soilless culture in greenhouse[D].Hohhot:Agricultural University of the Inner Mongol,2011.(in Chinese)

[15]張智猛,萬(wàn)書波,寧堂原,等.氮素水平對(duì)花生氮素代謝及相關(guān)酶活性的影響[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2008,(6):1407-1416.

Zhang Z M,Wan S B,Ning T Y,et al.Effects of nitrogen level on nitrogen metabolism and correlating enzyme activity in peanut[J].Journal of Plant Ecology,2008,(6):1407-1416.(in Chinese)

[16]王月福,于振文,李尚霞,等.氮素營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)冬小麥氮代謝關(guān)鍵酶活性變化和籽粒蛋白質(zhì)含量的影響[J].作物學(xué)報(bào),2002,(6):743-748.

Wang Y F,Yu Z W,Li S X,et al.Effect of nitrogen nutrition on the change of key enzyme activity during the nitrogen metabolism and kernel protein content in winter wheat[J].Crop Journal,2002,(6):743-748.(in Chinese)

[17]趙宏偉.不同氮素營(yíng)養(yǎng)水平下春玉米碳氮代謝機(jī)理的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

Zhao H W.Study on the mechanism of carbon and nitrogen metabolism of spring maize under different nitrogen levels[D].Harbin:Northeast Agricultural University,2003.(in Chinese)

[18] 岳紅賓.不同氮素水平對(duì)煙草碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響[J].中國(guó)煙草科學(xué),2007,28(1):18-20.

Yue H B.Effects of different nitrogen levels on the activities of key enzymes of carbon and nitrogen metabolism in tobacco[J].Chinese Tobacco Science,2007,28(1):18-20.(in Chinese)

[19]劉明,呂愛鋒,武建軍,等.干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)影響研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2014,30(32):165-171.

Liu M,Lv A F,Wu J J,et al.A review of impacts of drought on agro-ecosystem[J].Chinese Agricultural Science Bulletin, 2014,30(32):165-171.(in Chinese)

[20] 王奎穩(wěn).設(shè)施葡萄秋季施肥技術(shù)[J].落葉果樹,2016,(3):52.

Wang K W.Autumn fertilization techniques for protected grapes[J].Deciduous Fruit Tree,2016,(3):52.(in Chinese)

[21]倪榮梅.不同水肥管理對(duì)設(shè)施葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的影響研究[J].新疆農(nóng)墾科技,2016,39(4):62-64.

Ni R M.Effects of different water and fertilizer management on yield and quality of protected grape[J].Xinjiang Agricultural Reclamation Science and Technology,2016,39(4):62-64.(in Chinese)

[22]Bao S D.Soil and agricultural chemistry analysis[M].Beijing:China Agriculture Press,1999.

[23] 陳建勛,王曉峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].廣州:華南理工大學(xué)出版社,2015.

Chen J X,Wang X F.Experimental guidance of plant physiology[M].Guangzhou:South China University of Technology Press,2015.(in Chinese)

[24]葉利庭,呂華軍,宋文靜,等.不同氮效率水稻生育后期氮代謝酶活性的變化特征[J].土壤學(xué)報(bào),2011,48(1):132-140.

Ye L T,Lv H J,S W J,et al.Changes of nitrogen metabolism enzyme activities in late growth stage of rice with different nitrogen efficiency[J].Journal of Soil Science,2011,48(1): 132-140.(in Chinese)

[25]向友珍,張富倉(cāng),范軍亮,等.基于臨界氮濃度模型的日光溫室甜椒氮營(yíng)養(yǎng)診斷[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2016,32(17):89-97.

Xiang Y Z,Zhang F C,Fan J L,et al.Nutrition diagnosis for N in bell pepper based on critical nitrogen model in solar greenhouse[J].Journal of the CSAE,2016,32(17):89-97.(in Chinese)

[26] 孫園園,孫永健,楊志遠(yuǎn),等.不同形態(tài)氮肥與結(jié)實(shí)期水分脅迫對(duì)水稻氮素利用及產(chǎn)量的影響[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,21(3):274-281.

Sun Y Y,Sun Y J,Yang Z Y,et al.Effects of different forms of nitrogen fertilizer and water stress on nitrogen use and yield in rice[J].Chinese Journal of Ecological Agriculture,2013, 21(3):274-281.(in Chinese)

[27]楊夕,郁松林,趙豐云,等.水分脅迫下硝酸鈉對(duì)葡萄幼苗氮代謝酶活性的影響[J].北方園藝,2018,(12):27-35.

Yang X,Yu S L,Zhao F Y,et al.Effect of sodium nitrate on the activity of nitrogen metabolism enzymes in grape seedlings under water stress[J].Northern Horticulture,2018,(12):27-35.(in Chinese)

[28]白澤晨.不同程度水分脅迫對(duì)赤霞珠葡萄幼樹氮素吸收代謝的影響[D].石河子:石河子大學(xué),2015.

Ba Z C.Effects of water stress on nitrogen absorption and metabolism of cabernet sauvignon young trees[D].Shihezi: Shihezi University,2015.(in Chinese)

[29]周衛(wèi),馬敬坤,王志強(qiáng),等.滲水分和鹽脅迫對(duì)水稻幼苗葉片氨同化的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2005,(4):521-524.

Zhou W,Ma J K,Wang Z Q,et al.Effects of water seepage and salt stress on ammonia assimilation in rice seedling leaves[J].Journal of Wuhan University(Science Edition), 2005,(4):521-524.(in Chinese)

Effect of Water and Nitrogen Coupling on Nitrogen Metabolism Enzyme Activities in Grapevine Seedling Leaves

LI Jia-shuai1, YANG Zai-qiang1,2, WANG Ming-tian3, WEI Ting-Ting1, ZHAO He-li1, JIANG Meng-yuan1, Sun Qing1, HUANG Qin-qin1

(1. Collaborative Innovation Center on Forecast and Evaluation of Meteorological Disasters, Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China；2. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Agrometeorology, Nanjing 210044；3. Sichuan Meteorological Bureau, Chengdu 610071)

In order to study the effect of water and nitrogen coupling on nitrogen metabolism of grape leaves at seedling stage and the formulation of optimal nitrogen application, the annual "Hongti" grape was used as the research material. A comprehensive design of four levels of water and nitrogen in the greenhouse was used to carry out the experiment under the artificial environment control method. The water treatments were as follows: normal irrigation W1 (70%?80% of maximum water capacity in the field), mild stress W2 (60%?70%), moderate stress W3 (50%?60%) and severe stress (30%?40%).The levels of nitrogen application were as follows:1.5 times recommended fertilization N1 (pure nitrogen 25.5g·m?2), normal recommended fertilization N2(17g·m?2), 0.5 time recommended fertilization N3(8.5g·m?2), no nitrogen fertilizer N4(no nitrogen application).The treatment time was 10, 20, 30, 40 days. The results showed that the content of nitrate reductase (NR), glutamine synthetase (GS),glutamine-oxoglutarate aminotransferase(GOGAT), soluble protein and free amino acid increased with the increase of nitrogen application when moisture conditions were appropriate. When drought stress was mild, increased application of nitrogen fertilizer can alleviate drought stress .When drought stress was severe, high nitrogen treatment reduced the activities of nitrogen metabolism enzymes , the content of free amino acids and soluble proteins in the leaves of the grape. The nitrogen content in the leaves of grape always decreased with the increase of treatment time. Under mild water stress, the nitrogen transport rate was higher. When the water stress was severe, the nitrogen transport rate of treatment under high nitrogen and no nitrogen were lower. Finally, under the suitable water conditions (W1) and mild water stress (W2), the nitrogen metabolism ability of grape leaves under N1 (purified nitrogen 37.5g·m?2) was the highest. Under moderate water stress (W3) and severe water stress (W4), N3 (pure nitrogen 12.5g·m?2) and N4 (no nitrogen application) had the highest nitrogen metabolism capacity. The research results provide a theoretical basis for the prevention and control of drought disasters in the actual production of grapes, which can effectively alleviate the harm caused by water stress, and avoid the waste of fertilizer in production, so as to achieve less fertilizer efficiency.

Grape; Nitrogen metabolism; Water and nitrogen stress; Nitrogen content; Optimum N application

10.3969/j.issn.1000-6362.2019.06.004

收稿日期：2018?11?06

通訊作者。E-mail：yzq@nuist.edu.cn

江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2015693）；四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科技發(fā)展基金項(xiàng)目（省重實(shí)驗(yàn)室2018-重點(diǎn)-05）

李佳帥（1993?），女，研究方向?yàn)樵O(shè)施農(nóng)業(yè)氣象。E-mail：596993884@qq.com

李佳帥,楊再?gòu)?qiáng),王明田,等.水氮耦合對(duì)苗期葡萄葉片氮素代謝酶活性的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2019,40(6):368-379