劉擁亮,李紅梅

(高郵市產(chǎn)品質(zhì)量綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 高郵 200031)

1 引言

堿性橙Ⅱ(BasicOrangeⅡ)又被稱為“塊黃”是一種偶氮類堿性工業(yè)用的染料，將其加入制品中使其成為顏色漂亮而不易退色的亮黃色，在日常生活中主要用在一些紡織用品、皮革方面制品及木制家具等的亮黃色染色[1～5]。GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[6]在豆制品中堿性橙Ⅱ不得使用。堿性橙Ⅱ?qū)θ松眢w有致癌作用，本文研究了液相色譜紫外檢測(cè)外標(biāo)法定量豆制品中堿性橙Ⅱ的方法，此方法檢出限低重復(fù)性好，能夠作為日常豆制品中堿性橙Ⅱ含量的測(cè)定依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料、試劑和儀器

堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所)；豆制品(蘭庭農(nóng)貿(mào)購(gòu)買)；甲醇(色譜純)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；乙酸銨(分析純)，實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水(實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)自制)； 美國(guó)Waters e2695液相色譜配有W2487紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 液相色譜(LC)條件選擇

Waters公司產(chǎn)C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；甲醇(A相): 0.02 mol/L乙酸銨溶液(B相)體積比65∶35作為本次實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相；樣品進(jìn)樣量10 μL；液相色譜的流速1.0 mL/min；堿性橙Ⅱ最大吸收波長(zhǎng)為449 nm，采用最大吸收波張保留時(shí)間定性液相色譜-紫外檢測(cè)分析。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用甲醇溶解后定容至10 mL容量瓶中，搖勻，該溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取上述溶液并且用甲醇稀釋定容為5、10、25、50、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.2.3 樣品制備

稱取粉碎后20 g豆腐干試樣放入50 mL具塞離心管中，在離心管中加5 g無(wú)水硫酸鈉和25 mL無(wú)水乙醇超聲提取30 min，然后放入冷凍離心機(jī)離心，取離心管中上層提取液置于另外一只50 mL離心管中，在原先的離心管中再次加入10 mL無(wú)水乙醇，重復(fù)提取3次后合并上層提取液到離心管中， 將合并后的提取液減壓濃縮近干，用乙腈溶解，加入正已烷10 mL漩渦振蕩萃取10 min，棄去正已烷層，重復(fù)3次，將乙腈層減壓濃縮至近干，用無(wú)水乙醇溶解，氮?dú)獯蹈?，用甲醇液定容? mL，過(guò)膜，進(jìn)行HPLC分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相選擇

采取甲醇和乙酸銨20∶80，甲醇和乙酸銨40∶60，甲醇和乙酸銨65∶35三個(gè)梯度，甲醇比例在20%的時(shí)候分離度不太好，隨著甲醇比例增大，一直到65%的時(shí)候分離度最好，所以就選擇甲醇和乙酸銨=65∶35作為此次實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.2 線性范圍、回歸方程及檢出限

吸取堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液按照2.2.1條件進(jìn)行檢測(cè)，以儀器響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(g/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明：y=7.18e+004x-3.06e+004，R2=0.99986。堿性橙Ⅱ在5～100 μg/mL之間線性關(guān)系良好。并以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得堿性橙Ⅱ的檢出限為0.01 μg/mL(圖1)。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取在豆腐干檢測(cè)中堿性橙Ⅱ檢出的陽(yáng)性樣品，重復(fù)測(cè)定6次，記錄色譜圖，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.63%，說(shuō)明用本方法測(cè)豆腐干中堿性橙Ⅱ含量精密度和重復(fù)性良好(表1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

3.4 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

選擇中(0.5 mg和1.0 mg)、高(5.0 mg)和低(0.05 mg)四個(gè)濃度作為加標(biāo)量，在每個(gè)濃度選擇測(cè)定6個(gè)樣品，按照2.2.3前處理方法處理樣品，處理好的樣品進(jìn)液相色譜紫外檢測(cè)性定量分析。結(jié)果見表2，加標(biāo)回收率96.0%～99.8%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.45%～5.01%之間，方法精密度能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

3.5 樣品測(cè)定

樣品的測(cè)定：市場(chǎng)上購(gòu)買的豆腐干樣品10份，按2.2.3方法制備樣品溶液，液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)，計(jì)算含量，有2份樣品檢出堿性橙Ⅱ，含量在1.1 μg/mL左右，其余8份樣品沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)，顯示陰性結(jié)果。堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見圖2和圖3，堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間在4.9 min左右。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)

圖2 堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)譜圖

圖3 樣品譜圖

4 結(jié)論

本文采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)豆制品中非法添加物質(zhì)堿性橙Ⅱ中含量，結(jié)果表明：采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為449 nm，液相色譜分析條件：采用C18柱，流動(dòng)相甲醇(A相):乙酸銨(0.02 mol/L)(B相)體積比65∶35，本方法線性范圍5～100 μg/mL，最

低檢出限為0.01 μg/mL，中(0.5 mg和1.0 mg)、高(5.0 mg)和低(0.05 mg)4個(gè)濃度的加標(biāo)回收率在96.0%～99.8%。該方法適用于日常檢測(cè)豆制品中堿性橙Ⅱ定量分析。