戴詩(shī)云,毛哲浩,胡益祥,李凡榮,孫 瑞,高 治, 王 亮

(徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004)

1 引言

我國(guó)幅員遼闊，地理環(huán)境復(fù)雜，這種獨(dú)一無二的自然生態(tài)環(huán)境培育了大量的特有植物資源，為植物提取物活性成分的抑菌作用的研究提供了得天獨(dú)厚的有力條件。如何利用這些植物資源的活性成分，研制出相關(guān)的抑菌藥物成了現(xiàn)代生物科學(xué)重要的研究方向。本文主要是研究生活中常見的植物提取相關(guān)的活性成分對(duì)大腸桿菌等菌種的抑菌效果。

龍眼是無患子科龍眼屬植物，目前在我國(guó)一些處于亞熱帶季風(fēng)氣候的地區(qū)有大面積的種植?，F(xiàn)如今的龍眼果實(shí)加工大多為以龍眼干、果肉罐頭為主，龍眼核在加工的過程中利用率不高，而研究龍眼核的醫(yī)用價(jià)值、生產(chǎn)價(jià)值可以達(dá)到廢物利用的效果，并且龍眼核作為生產(chǎn)的副產(chǎn)品，可以提高果農(nóng)的收入。本文對(duì)龍眼核抑菌活性能力的研究也得出其具有相當(dāng)大的潛力。石榴果皮中含有多種生物堿，抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，石榴果皮的醇提取物具有廣泛抗菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、霍亂弧菌、瘧疾桿菌等有明顯的抑制作用，此外，石榴果皮的水浸劑在適宜的環(huán)境下對(duì)各種皮膚真菌也具有不同程度的抑制作用，所以在中醫(yī)中石榴皮是治療痢疾、泄瀉、便血及遺精、脫肛等病癥的良品；現(xiàn)代藥理研究表明石榴果皮中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、糖及其酚類、有機(jī)酸、黃酮類、生物堿等化學(xué)成分，具有殺菌、降血糖、抗癌、免疫功能調(diào)節(jié)，增強(qiáng)心血管系統(tǒng)功能等作用，為今后石榴果皮的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。核桃葉又稱胡桃葉，核桃葉中富含維生素C、B、D、E，胡蘿卜素、胰島素多糖、有機(jī)酸、無機(jī)鹽等。對(duì)患有維生素缺乏癥、甲狀腺腫大、黃膽病、婦科病皮膚病等均有顯著功效。

2 材料與方法

2.1 供試菌種

大腸桿菌、沙門氏菌、革蘭氏陽(yáng)性枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌

2.2 供試植物材料

取市場(chǎng)上購(gòu)得的新鮮龍眼去殼和肉后得到龍眼核，龍眼核50 ℃烘干至恒重備用；提前儲(chǔ)備的石榴果皮，洗凈，去除萼筒，手工取皮，室內(nèi)陰干，粉碎后過40目篩4 ℃度冷藏備用；采購(gòu)所得核桃葉，精心保存。

2.3 植物提取物制備所需材料

牛津杯(杯內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm)氨芐西林和頭孢挫林藥敏濾紙片。

ZPS-250智能生化培養(yǎng)箱、ES-315 TOMY高壓蒸汽滅菌鍋、T-203電子天平、BCN-1360B生物潔凈工作臺(tái)、FW100型高速萬能粉碎機(jī)、PK121R冷凍離心機(jī)、THZ-82A水浴恒溫振蕩器、LXJ-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2.4 植物提取物母液的制備

龍眼核提取物制備[1]：將提前準(zhǔn)備好的龍眼核用粉碎機(jī)粉碎成粉末，然后用T-203電子天平稱取粉末100 g置于燒杯中，接著加入500 mL的乙醇并置于50 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌浸提4h，4h后將浸泡后的溶液放入離心機(jī)。首先，打開臺(tái)式的高速離心機(jī)，使離心機(jī)進(jìn)入待機(jī)狀態(tài)。要注意的是在離心時(shí)，離心管內(nèi)所盛溶液不能超過離心管總?cè)萘康?/3，如若超出，易容易溢出。使用前后，都應(yīng)注意轉(zhuǎn)頭內(nèi)是否保持干燥狀態(tài)。轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)頭時(shí)應(yīng)注意使離心機(jī)轉(zhuǎn)軸和轉(zhuǎn)頭的卡口卡牢。離心管平衡誤差應(yīng)在0.1 g以內(nèi)。選擇離心參數(shù)：①按溫度設(shè)置按鈕，設(shè)定離心溫度；②按速度設(shè)置按鈕，可在RPM/RCF設(shè)置檔之間切換，用數(shù)字鍵設(shè)置離心速度，回車確定；③按轉(zhuǎn)頭設(shè)置按鈕，再用數(shù)字鍵設(shè)置轉(zhuǎn)頭型號(hào)，回車確定；④按時(shí)間設(shè)置按鈕，再用數(shù)字鍵設(shè)置離心時(shí)間，回車確定；⑤離心機(jī)剎車或加速速度一般設(shè)置在0～4之間，不宜經(jīng)常調(diào)整。將平衡好的離心管對(duì)稱放入轉(zhuǎn)頭內(nèi)。蓋好轉(zhuǎn)頭蓋子擰緊螺絲。按下離心機(jī)蓋門，如蓋門未蓋牢，離心機(jī)將不能啟動(dòng)。按START鍵，開始離心。離心開始時(shí)，確保離心速度達(dá)到規(guī)定速度后方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。如若出現(xiàn)因?yàn)樵嚬芊诺牟黄胶鈱?dǎo)致離心機(jī)明顯震動(dòng)，應(yīng)立即停止離心的操作，如有必要，應(yīng)該直接關(guān)閉離心機(jī)并找出失誤的原因。經(jīng)離心得到上清液，連續(xù)浸提2次，合并上清液，在55 ℃溫度下減壓濃縮后定容至濃度為1 g/mL。

石榴果皮溶劑提取[4]：用T-203電子天平稱取石榴果皮40 g，用5倍于樣品的乙醇溶劑作為萃取溶劑，并且在30 ℃下浸提48h，用濾紙過濾，混勻后放入離心機(jī)離心，蒸發(fā)濃縮得到不同浸膏，再用25%乙醇溶解，定容至濃度為1 g/mL。

核桃葉提取物制備[5]：取事先準(zhǔn)備好的核桃葉干粉，以70%乙醇為提取溶劑，回流提取3次(5 h-3 h-2 h)，合并三次提取的溶液，抽濾后蒸發(fā)掉上清液至膏狀，定容10 mL備用。

2.5 菌懸液的制備

提前將實(shí)驗(yàn)所需菌種用合適的培養(yǎng)基進(jìn)行活化，量取10 mL無菌水于試管中，然后使用接種環(huán)磨擦培養(yǎng)基表面，取出接種環(huán)，最后將接種環(huán)放入無菌水中，充分振蕩搖勻得到菌懸液。

2.6 植物提取物抑菌活性的測(cè)定

龍眼核提取物對(duì)供試菌種的抑菌活性的測(cè)定：對(duì)病原菌絲生長(zhǎng)的抑制作用采用生長(zhǎng)速率法[2]。無菌條件下，用孔徑為0.8 cm的打孔器取菌落邊緣生長(zhǎng)旺盛的菌種移入含有提取物0.01 g/mL的PDA 培養(yǎng)平板上 ( 極性小的粗提物先溶解在少量丙酮再與40-50 ℃瓊脂培養(yǎng)基混合,以利均勻分散),于培養(yǎng)基內(nèi)加等量無菌水為對(duì)照,每處理重復(fù)3次,26 ℃恒溫培養(yǎng),待對(duì)照菌落接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí),測(cè)定菌落直徑。

石榴果皮提取物對(duì)供試菌種的抑菌活性的測(cè)定：該步驟采用濾紙片法(k-b法)[6]。將采用高壓滅菌法后的培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃，在無菌環(huán)境下，將滅菌過后的培養(yǎng)基分別倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿1 mL，接著在每皿中加入準(zhǔn)備好的菌懸液1 mL，用刮鏟涂抹均勻，然后取用5%的鞣化柞蠶絲素粉混懸液浸泡3 h，干熱滅菌后用無菌鑷子夾取6 mm的圓濾紙片，分別浸漬提取液60s后取出，濾干提取液后貼于瓊脂平板上，每皿放置三片，每個(gè)紙片間的距離等距，重復(fù)3次，將細(xì)菌置于28 ℃恒溫箱24 h，最后使用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取其平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

楊桃葉提取物對(duì)供試菌種的抑菌活性的測(cè)定：將經(jīng)過活化的試驗(yàn)用菌接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，細(xì)菌經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h，使菌液濃度達(dá)到10.8 cfu/mL備用。在無菌條件下吸取適量的菌懸液加入到備用的平板培養(yǎng)基上，涂布均勻。灼熱玻璃棒在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上燙出8 mm直徑孔，每孔加入25 μL提取液，做3次重復(fù)，以水做空白對(duì)照。37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。取其平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1～3。

表1 不同供試植物的乙醇提取物的抑菌效果比較

注：-為抑菌圈直徑為0，即無抑菌活性

表3 不同供試植物乙醇提取物濃度為25 mg/mL時(shí)的抑菌活性比較

由表1的抑菌結(jié)果可以看出：①核桃葉的乙醇提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有較強(qiáng)的抑菌能力，對(duì)沙門氏菌的沒有很強(qiáng)的抑菌作用。②龍眼核與核桃葉的乙醇提取物對(duì)這4種細(xì)菌的抑制作用順序一致，即：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。③石榴果皮的乙醇提取物對(duì)這4種細(xì)菌的抑菌能力相差不大。

由表2、3的結(jié)果可以看出：①在乙醇濃度很高時(shí)，龍眼核對(duì)指示菌沒有抑菌作用。②隨著提取物濃度的增加，石榴果皮、核桃葉對(duì)4種細(xì)菌的抑菌作用都有增強(qiáng)。③隨著3種植物提取物的濃度的改變，3種植物提取物仍然是對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)。

由表1、2、3的結(jié)果可以分析：隨著3種植物提取物濃度的變化，它們對(duì)4種細(xì)菌的抑制效果也有著不同的變化。因此，可以猜測(cè)它們抑菌能力變化的原因是不同濃度的提取物中含有的抑菌活性成分量不同，并且含有抑菌活性成分越多，對(duì)對(duì)應(yīng)細(xì)菌的抑菌效果越顯著。

4 小結(jié)與討論

龍眼核對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有明顯的抑菌效果，但是對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力更為突出。在以后的實(shí)驗(yàn)研究中可以著重對(duì)龍眼核提取物抑制金黃色葡萄球菌做進(jìn)一步研究。石榴果皮對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌直徑大致相當(dāng)，可見石榴果皮的活性成分的對(duì)所選的菌種的抑菌能力大致相當(dāng)，在以后的實(shí)驗(yàn)研究上可以把突破點(diǎn)放在對(duì)石榴果皮提取物的活性成分能否對(duì)大部分細(xì)菌都普遍具有抑菌效果做進(jìn)一步的研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核桃葉、石榴果皮、龍眼核都具有良好的體外抑菌能力，但目前對(duì)這三者都處于實(shí)驗(yàn)研究狀態(tài)。未來龍眼核的實(shí)際應(yīng)用應(yīng)該在于對(duì)龍眼核保健食品的加工，應(yīng)用于天然色素和食品著色添加劑，以及龍眼核提取液的純化、精制和實(shí)際應(yīng)用等。龍眼核的充分利用，對(duì)于提高龍眼的實(shí)用價(jià)值，提高農(nóng)民種植龍眼的經(jīng)濟(jì)效益，有著深遠(yuǎn)的實(shí)際意義，有利于進(jìn)一步拓寬農(nóng)民增收渠道，產(chǎn)生一定的社會(huì)效益。

石榴果皮中含有豐富的藥理活性成分，對(duì)人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化道系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的疾病和抗菌、抗病毒等方面均有顯著的療效，但目前其藥理價(jià)值還不能充分的應(yīng)用于臨床方面，未來可以加強(qiáng)石榴果皮提取的活性成分與臨床應(yīng)用方面的研究，在確保臨床用藥安全的前提下，為新藥的開發(fā)打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。石榴果皮具有廣闊的開發(fā)前景。

現(xiàn)代藥理研究表明，核桃葉提取物與改善記憶和抗腫瘤等作用有很大的關(guān)系，為了更全面的了解核桃葉提取物的多方面活性，本文只研究核桃葉提取物活性成分對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌能力，為核桃葉在未來的植物抑菌方面開發(fā)與應(yīng)用提供一些理論基礎(chǔ)。