趙利娜，盧 萍

(內(nèi)蒙古師范大學 生命科學與技術(shù)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022)

1 引言

小花棘豆(OxytropisglabraO.glabra)是生長于荒漠草原低濕地隸屬于豆科(Leguminose)棘豆屬(OxytropisDC.)的多年生草本植物，與黃芪屬(AstragalusstragalusA.stragalus)統(tǒng)稱為瘋草，整個生長周期均含有毒生物堿-苦馬豆素(swainsonine,SW)[1]。SW結(jié)構(gòu)類似甘露糖的陽離子半椅式構(gòu)象，與甘露糖苷競爭性結(jié)合，對α-甘露糖苷酶的活性具有抑制作用，使牲畜細胞功能出現(xiàn)紊亂[2]，發(fā)生中毒癥狀，嚴重者致死，給草原上畜牧業(yè)帶來極大的損失[3]。研究者對含有SW的植物體進行研究，發(fā)現(xiàn)其毒性是由于植物體分離培養(yǎng)的內(nèi)生真菌合成的[4]。酵母氨酸還原酶基因(saccharopine reductase gene,sac)編碼酵母氨酸還原酶(saccharopine reductase,Sac)[5]，是合成SW代謝途徑中重要前體化合物[6，7]。本文主要對豆類絲核菌(Rhizoctonialegumimicola,R.legumimicola)、金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae,M.anisopliae)、稻瘟病菌(Magnaporthegrisea,M.grisea)以及瘋草內(nèi)生真菌(Alternariaoxytropis,A.oxytropis,)等微生物合成苦馬豆素途徑中sac對其代謝影響進行綜述。

2 酵母氨酸還原酶

酵母氨酸還原酶基因編碼酵母氨酸還原酶，在微生物中賴氨酸由二氨基庚二酸和α-氨基己二酸兩條途徑分別合成，在α-氨基己二酸途徑中，α-氨基己二酸半醛 Sac 酵母氨酸→ 賴氨酸，酵母氨酸是合成賴氨酸的中間產(chǎn)物[5]。反應過程中Sac的熱穩(wěn)定性較差，在46 ℃時，酶失活發(fā)生雙向反應，緩沖液pH值為中性時，發(fā)生正向反應，生成酵母氨酸；緩沖液pH值為堿性時，發(fā)生逆向反應，生成谷氨酸[8]。

1988年P(guān)earson等在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae)中克隆到sac[9]。2000年Johansson等在M.grisea中克隆到sac(GenBank登陸號：AF144424)，與S.cerevisiae的sac的序列比對一致度達63%，并在M.grisea中提取到Sac粗酶對其進行了純化[10]。隨后2006年接著對Sac利用分子置換法發(fā)現(xiàn)其單體酶分別由結(jié)構(gòu)域I的折疊變體Rossmann(用于結(jié)合NADPH)、結(jié)構(gòu)域Ⅱ折疊成α/β結(jié)構(gòu)(用于結(jié)合糖蛋白并參與二聚體形成)和結(jié)構(gòu)域Ⅲ為全螺旋折疊(用于與底物結(jié)合時，關(guān)閉酶的活性位點)三部分組成[12]。對S.cerevisiae和M.grisea的Sac氨基酸結(jié)構(gòu)進行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域II具有最高數(shù)量的保守殘基，在底物結(jié)合和空間定向中結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅲ中起到重要作用[11]。2008年Albang等在產(chǎn)黃青霉菌Penicillium chrysogenum中克隆到sac序列(GenBank登陸號：XM002564566)，隨后利用同源重組獲得了sac失活突變株[13，14]。

2010年Mukherjee等利用簡并PCR在A.oxytropis中克隆到sac的cDNA序列(GenBank登陸號：HQ010362)[15]。盧萍課題組在2014年對內(nèi)蒙古的O.glabra體外分離得到內(nèi)生真菌，利用RACE獲得sac的cDNA序列(NCBI登錄號:KJ944635)，簡并PCR克隆到sac的DNA序列(NCBI登錄號：KY052048)，與從美國A.oxytropis克隆得到的sac的cDNA序列一致度為82.3%[16]。隨后構(gòu)建sac缺失載體，獲得sac基因缺失突變株M1[17]，通過Southern雜交，檢測到M1中的sac中間片段已被敲除，且hph整合到M1的基因組中[18]。成功構(gòu)建A.oxytropis內(nèi)生真菌sac互補表達載體，獲得A.oxytropis內(nèi)生真菌sac互補株C1[19]。

3 苦馬豆素的性質(zhì)及其來源

SW又名吲哚茲定三醇(indolizidine triol)，是一種多羥基吲哚茲定的有毒生物堿，化學式為C8H15NO3[20]。因化學結(jié)構(gòu)與甘露糖相識度高，強力抑制α-甘露糖苷酶的活性，致使動物細胞溶酶體內(nèi)的α-甘露糖苷大量貯積，細胞合成糖蛋白發(fā)生障礙，細胞出現(xiàn)空泡變性[21]。牲畜大量采食影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、肝功能損傷，免疫系統(tǒng)絮亂，嚴重者致死。近年由于SW可促進骨髓細胞和免疫細胞的增生以及細胞分化，也可以直接對腫瘤細胞進行抑制，改變細胞表面的糖基化，配合化療藥物促進細胞殺傷腫瘤細胞，使腫瘤細胞凋亡，廣泛用于機體增強免疫功能和癌癥的治療，目前SW主要從植物體內(nèi)提取、化學人工合成和產(chǎn)SW的真菌中提取[22]。

Colegate等首次于1979年在灰苦馬豆(Swainsonacanescens)植物體中分離提取到SW，并將其命名為SW[23]。隨后Molyneux等在絹毛棘豆和黃芪中檢測到高濃度SW，認為致使牲畜中毒主要是因為其植物體含SW[24]。1989年曹光榮等從黃花棘豆(OxytropisochrocephalaBunge)中分離到SW，并證實SW致使細胞形成空泡化，使其失去功能后逐漸死亡[25]。1995年Sim等從M.anisopliae分離到SW，利用酶分析法測得SW的水平[26]。2003年Braun等在絹毛棘豆Oxytropissericea、斑莢膜黃芪(Astragalusmollisimus)和藍伯氏棘豆(OxytropislambertiiO.lambertii)3種植物體的不同部位，通過體外分離培養(yǎng)得到內(nèi)生真菌，經(jīng)過形態(tài)學和分子生物學鑒定為Embellisia，并認為體外培養(yǎng)該內(nèi)生真菌可合成SW[27]。盧萍等2004年在內(nèi)蒙古O.glabra植物體中體外分離培養(yǎng)到內(nèi)生真菌[28]，觀察形態(tài)以及5.8S rDNA/ITS序列比對，一致度達99.8%，鑒定為Embellisia，并發(fā)現(xiàn)小花棘豆毒性來源體外培養(yǎng)的內(nèi)生真菌Embellisia，含該內(nèi)生真菌的小花棘豆宿主均含SW，不含該內(nèi)生真菌的宿主測不出SW[28]。Ralphs等在2008年從美國瘋草不同屬植株體中均分離到含SW的內(nèi)生真菌Embellisia[30]。Cook在2009年對不同種的群絹毛棘豆中的SW水平進行研究發(fā)現(xiàn)，SW水平高的種群植株分離到的內(nèi)生真菌多，而SW水平低的種群分離到的內(nèi)生真菌少[31]。

2009年P(guān)ryor等對從O.lambertii和O.kansuensis中分離到的內(nèi)生真菌進行研究，認為其分生孢子有較厚的橫壁，形狀為倒棒狀或卵形，但由于分生孢子形狀為波浪形，有分支芽管，又經(jīng)5.8S rDNA/ITS1-ITS2序列測序分析比對，將內(nèi)生真菌Embellisia修訂為Undifilum[32]，2014年Woudenberg等又將Undifilum歸到Alternaria[33-34]，小花棘豆內(nèi)生真菌的學名修訂為Alternaria oxytropis(A.oxytropis)。利用qPCR法對O.glabra植物體的不同部位中內(nèi)生真菌數(shù)量及SW水平檢測分析，發(fā)現(xiàn)不同植物體部位內(nèi)生真菌數(shù)量不同，SW水平也不同[36]。

4 Sac影響真菌中SW的合成

1988年Harris等研究R.legumimicola中合成SW的生物代謝途徑，提出SW的代謝途徑可能為：賴氨酸→酵母氨酸→L-2-氨基己二酸半醛→1,6-二六氫哌啶酸(P6C)→哌啶酸→1-酮基吲哚里西啶，隨后1-酮基吲哚里西啶通過兩條途徑從順式羥基吲哚里西啶和反式羥基吲哚里西啶分別的生成根霉菌氨(S型-C)和SW(R型-C)[37]。1990年Wickwire等對合成SW途徑中的哌啶酸進行研究，發(fā)現(xiàn)賴氨酸→酵母氨酸→P6C→哌啶酸，哌啶酸是由賴氨酸生成的，且哌啶酸是合成SW的前體物[38](圖1)。

圖1 豆科絲核菌中SW合成代謝途徑

1997年Sim等在M.anisopliae中分離得到SW，推測SW代謝途徑如圖2， SW分別從不同兩條路線生成P6C后，再合成SW，而賴氨酸是SW的前體化合物，在培養(yǎng)基中添加賴氨酸，菌絲體中哌啶酸和賴氨酸積累，添加2-氨基乙基半胱氨酸(AEC)，菌體中SW水平降低，但酵母氨酸量增多，菌體需要大量賴氨酸與AEC競爭，使酵母氨酸合成賴氨酸，生成SW[39]。

圖2 金龜子綠僵菌中SW合成代謝途徑

Mukherjee等的研究表明，敲除 A.oxytropis 內(nèi)生真菌中的sac，SW隨著哌啶酸的增加而增加，Sac的活性影響SW合成[40]。2012年楊國棟等對賴氨酸上的C、N原子標記進行示蹤實驗，發(fā)現(xiàn)C、N進入到了SW，在培養(yǎng)基內(nèi)分別添加α-酮戊二酸、賴氨酸以及哌啶酸，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)添加了化合物的內(nèi)生真菌中SW水平高于未添加的實驗對照組，且添加哌啶酸對合成SW的影響最大[40]。隨后發(fā)現(xiàn)添加化合物不僅影響合成SW水平也影響內(nèi)生真菌的生長速率[42]。2016年盧萍等利用HPLC-MS法檢測到M1中的酵母氨酸的含量低于OW7.8，賴氨酸的含量沒有明顯變化[43]，接著課題組在OW7.8和M1培養(yǎng)基內(nèi)添加不同濃度a-氨基己二酸、賴氨酸、哌啶酸、培養(yǎng)不同天數(shù)的內(nèi)生真菌中的SW水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)添加前體物均促進OW7.8和M1內(nèi)生真菌中SW的合成，添加化合物的OW7.8的SW含量高于添加化合物的M1[7]。

2017年路浩等在基因組測序了 A.oxytropis 內(nèi)生真菌，對內(nèi)生真菌中的基因組進行了草圖組裝，共發(fā)現(xiàn)含蛋白質(zhì)編碼基因有11057個，其中發(fā)現(xiàn)164個基因可對酶進行編碼，推測在合成SW途徑中酵母氨酸還原酶、酵母氨酸氧化酶、吡咯啉-5-羧酸還原酶參與合成SW[44]。2017年Ren等研究 A.oxytropis 的SW合成途徑，推測SW可能是由P6C和P2C兩條途徑合成，其中，P6C合成途徑是由a-氨基己二酸 酵母氨酸脫氫酶 P6C→哌啶酸→1-酮基-吲哚里西啶→SW[45]；而P2C合成途徑是由賴氨酸→α-己酮酸→P2C→哌啶酸→1-酮基-吲哚里西啶→SW[46]，其合成SW途徑中的細節(jié)步驟及參與的催化酶尚不清晰，還需繼續(xù)深化研究[47]。A.oxytropis內(nèi)生真菌中SW合成代謝途徑如圖3。

圖3 內(nèi)生真菌合成SW的代謝途徑

5 展望

瘋草內(nèi)生真菌含有主要有毒成分SW，危害著草原以及畜牧業(yè)的發(fā)展，有學者發(fā)現(xiàn)SW具有較強的抗腫瘤作用，因而成為現(xiàn)下研究熱點。Sac敲除突變株M1的SW水平下降，Sac促進SW的合成。未來可通過轉(zhuǎn)錄組分析、中間代謝物檢測和關(guān)鍵基因的克隆與功能研究探索內(nèi)生真菌SW的生物合成途徑的詳細細節(jié)，深入揭示SW合成的分子機制，對于草原上瘋草植物小花棘豆植株進行遺傳改良和生態(tài)治理，實現(xiàn)對其綜合利用。