孔凡亭，王 坤，趙芳輝

(山東嘉譽(yù)測(cè)試科技有限公司，山東 淄博 255086)

1 引言

測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，它表征了可以合理地賦予被測(cè)量的量值分散程度[1]。葉綠素是植物光合作用中的重要光和色素，是藻類重要的組成成分之一，其濃度與水環(huán)境質(zhì)量有直接關(guān)系[2,3]。在地表水環(huán)境檢測(cè)中，正確評(píng)估葉綠素a的測(cè)量不確定度具有重要意義[4]。本文用分光光度法對(duì)地表水中葉綠素a檢測(cè)過程中引起的不確定度的各個(gè)分量來源進(jìn)行了分析，并對(duì)其不確定度進(jìn)行了合理的評(píng)定。

2 檢測(cè)方法

2.1 方法依據(jù)

依據(jù)HJ897-2017 《水質(zhì) 葉綠素a的測(cè)定 分光光度法》，對(duì)水中葉綠素a的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定。

2.2 方法原理

將一定量樣品用濾膜過濾截留藻類，研磨破碎藻類細(xì)胞。用丙酮溶液提取葉綠素，離心分離后分別于750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定提取液吸光度，根據(jù)公式計(jì)算水中葉綠素a的濃度。

2.3 操作步驟

按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行樣品的采集。樣品的采集一般使用有機(jī)玻璃采水器或其他適當(dāng)?shù)牟蓸悠鞑杉嫦?.5 m樣品，湖泊、水庫根據(jù)需要可進(jìn)行分層采樣或混合采樣，采樣體積為1 L或500 mL。如果樣品中含沉降性固體(如泥沙等)，應(yīng)將樣品搖勻后倒入2 L量筒，避光靜置30 min,取水面下5 cm樣品，轉(zhuǎn)移至采樣瓶。在每升樣品中加入1 mL碳酸鎂懸濁液，以防止酸化引起色素溶解。

2.4 儀器設(shè)備

配真空泵和玻璃砂芯過濾裝置，玻璃研缽研磨裝置，TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，15 mL玻璃刻度離心管(旋蓋材質(zhì)不與丙酮反應(yīng))，752 N紫外可見分光光度計(jì)(配10 mm石英比色皿)。

3 建立數(shù)學(xué)模型

3.1 葉綠素a含量

根據(jù)公式1計(jì)算葉綠素a含量：

c=

(1)

式(1)中：c為葉綠素a含量,mg/L；A664為試樣在664 nm波長(zhǎng)下的吸光度值；A647為試樣在647 nm波長(zhǎng)下的吸光度值；A630為試樣在630 nm波長(zhǎng)下的吸光度值；A750為試樣在750 nm波長(zhǎng)下的吸光度值；V1為提取定容后的體積，10 mL；V2為樣品體積，L；δ為比色皿光程，cm。

3.2 葉綠素a濃度c的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由公式(1)可見，被測(cè)樣品葉綠素a質(zhì)量濃度c的合成不確定度，來源于樣品前處理過程中樣品體積(量筒)引入的不確定度u(V1)、樣品提取時(shí)定容體積引入(容量瓶)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V2)、樣品重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(S)、比色皿光程的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(δ)、分光光度計(jì)透射比最大允差對(duì)測(cè)量值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(CT)五個(gè)部分。根據(jù)不確定度的傳播規(guī)律得出葉綠素a質(zhì)量濃度c的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見公式(2)：

(2)

式(2)中：uc(C)為樣品中葉綠素a含量測(cè)定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(V1)為前處理后樣品定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(V2)為樣品體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(S)為測(cè)量樣品重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(δ)為比色皿光程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(CT)為分光光度計(jì)透射比最大允差對(duì)測(cè)量值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

4 不確定度分量的來源分析

由檢測(cè)方法和數(shù)學(xué)模型分析，其不確定度來源有以下幾個(gè)方便：①實(shí)驗(yàn)中量取樣品體積(500 mL量筒)引入的不確定度；②樣品經(jīng)前處理后定容體積(10 mL容量瓶)引入的不確定度；③測(cè)量樣品重復(fù)性引入的不確定度；④結(jié)果測(cè)定中分光光度計(jì)比色皿光程引入的不確定度；⑤分光光度計(jì)透射比最大允差對(duì)測(cè)量值引入的不確定度。

5 不確定度分量的評(píng)定

5.1 樣品體積(量筒)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因本次測(cè)得值量取的樣品體積為500 mL，所以選用500 mL量筒量取。500 mL量筒引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來源于玻璃量具的最大允差、溫度變化引起的體積改變。

5.1.1 500 mL量筒允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

500 mL量筒(A級(jí)，量出式)最大允差為5.0 mL，屬A類評(píng)定，則：

5.1.2 溫度變化引起量筒體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

設(shè)溫度變化±3 ℃，水的膨脹系數(shù)α=2.1×10-4℃-1，則：

5.1.3 500 mL量筒引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

500 mL量筒刻度線讀數(shù)重復(fù)性的不確定度較小，可忽略不計(jì)。則500 mL量筒引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

5.2 定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來源于玻璃量具的最大允差、溫度變化引起的體積改變。

5.2.1 10 mL容量瓶允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

按A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)容器要求，10 mL容量瓶允差為0.02 mL，屬A類評(píng)定，則：

5.2.2 溫度變化引起容量瓶體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

設(shè)溫度變化±3 ℃，水的膨脹系數(shù)α=2.1×10-4℃-1，則：

5.2.3 定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

10 mL容量瓶定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

5.3 測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

5.3.1 樣品測(cè)量值

根據(jù)1.3操作步驟對(duì)某地表水樣品進(jìn)行測(cè)定(取樣體積500 mL)，測(cè)量值為2.40 mg/m3,原始數(shù)據(jù)見表1，本實(shí)例中的不確定度評(píng)定以該測(cè)量值為對(duì)象展開。

表1 樣品原始記錄(取樣量為500 mL)

5.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

從近年來的地表水葉綠素q樣品中，選取10組質(zhì)量濃度值相近的平行雙樣的結(jié)果(樣品體積均為500 mL，質(zhì)量濃度在2～5 mg/m3)，見表2。計(jì)算重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

5.3.3 評(píng)定方法與計(jì)算

5.3.3.1 評(píng)定方法

通過兩次平行試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出△i分散性標(biāo)準(zhǔn)差s(△i),進(jìn)而推導(dǎo)出單次試驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度Sp(qi),而Sp(qi)正是樣品重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(S)。

(2)計(jì)算公式如下：

△i=|q1-q2|

(3)

(4)

(5)

(6)

5.3.3.2 計(jì)算結(jié)果

測(cè)量樣品重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算如下。

(1)將每組樣品測(cè)量值q1，q2代入公式(3)中，求出20個(gè)△i結(jié)果。

表2 平行雙樣數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

注：n為平行雙樣組次：q1，q2為平行雙樣的兩個(gè)測(cè)量值

(7)

(4) 再將s(△i)結(jié)果代入公式(6)，得到單次結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(8)

(5) 已知測(cè)量值為2.40 mg/m3，可得到測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(9)

5.4 比色皿光程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

JJG178-2007 規(guī)定，比色皿光程最大允差為±0.5%，按照B類評(píng)定，則比色皿光程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(10)

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(δ)=1 cm×urel(δ)=1 cm×2.89×10-3cm。

5.5 分光光度計(jì)透射比最大允差對(duì)測(cè)量結(jié)果引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

5.5.1 評(píng)定方法

分光光度計(jì)透射比的最大允差為T=±0.5%，用討論系統(tǒng)誤差的方法來計(jì)算該允差對(duì)測(cè)量值的影響。以葉綠素a測(cè)得值2.40 mg/m3進(jìn)行評(píng)定，由表4可知，該樣品提取液4個(gè)波長(zhǎng)的平均吸光度值分別為0.016(A664),0.018(A647),0.012(A630),0.004(A750)，將此系列數(shù)據(jù)代入公式：吸光度A=lg(1/T)中將吸光度換算為透射比T，則樣品提取液測(cè)定吸光度換算出的透射比分別為：T664=96.383%,T647=95.940%,T630=97.275%,T750=99.083%。

當(dāng)透射比增加0.5%時(shí)，T+664=96.883%,T+647=96.440%,T+630=97.775%,T+750=99.583%，此時(shí)的吸光度值分別為：0.01375，0.01574，0.00977，0.00181。

當(dāng)透射比減少0.5%時(shí)，T-664=95.883%,T-647=95.440%,T-630=96.775%,T-750=98.583%，此時(shí)的吸光度值分別為：0.01826，0.02027，0.01424，0.00620。計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 透射比最大允差對(duì)測(cè)量值引入的不確定度分析計(jì)算

5.5.2 分光光度計(jì)透射比最大允差對(duì)測(cè)量結(jié)果引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

由表4可見，當(dāng)透射比增加0.5%時(shí)，測(cè)量結(jié)果為2.39 mg/m3，當(dāng)透射比減少0.5%時(shí)，測(cè)量結(jié)果為2.41 mg/m3，因此，可以認(rèn)為透射比允差造成的不確定度半寬a是對(duì)稱分布的。則

則透射比最大允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)上述分析及計(jì)算結(jié)果，列出不確定度分量一覽表，見表5。

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表5 不確定度分量一覽

當(dāng)取樣體積為500 mls時(shí)，樣品質(zhì)量濃度c=2.40 mg/m3?？捎?jì)算出：

7 計(jì)算擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2(約95%置信概率)，則擴(kuò)展不確定度：

U=kuc(c)=2×0.08 mg/m3=0.16 mg/m3。

8 結(jié)論

(1)分析結(jié)果可以看出，用分光光度法測(cè)定水體葉綠素a，當(dāng)采樣量為500 mL，測(cè)量值為2.40 mg/m3時(shí)，測(cè)量不確定度結(jié)果表示為：(2.40±0.16)mg/m3，k=2。

(2)影響水體葉綠素a含量的測(cè)量不確定度分量主要是測(cè)量樣品重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(3)采用估算法來評(píng)定分光光度計(jì)透射比最大允差對(duì)測(cè)量值引入的不確定度計(jì)算結(jié)果相對(duì)可靠直觀。