朱瑜 編譯，趙晨 審校

(成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052)

1 前言

現(xiàn)在，約20%上市藥是生物制藥，這是因?yàn)樯镏扑幧a(chǎn)效率比傳統(tǒng)小分子藥物高得多，預(yù)計(jì)2020年，全球生物醫(yī)藥市場預(yù)計(jì)將達(dá)到3060億美元。北美是生物制藥的最大市場，2012年銷售額為636億美元，其中單克隆抗體占大多數(shù)(246億美元)，其次是激素(161億美元)和生長因子(81億美元)。20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)的發(fā)展，利用相對廉價(jià)的微生物宿主系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了生物藥物生產(chǎn)的可控性和可擴(kuò)展性。目前，用于生物制藥的宿主有哺乳動(dòng)物細(xì)胞(39%)，雜交瘤細(xì)胞(11.2%)，酵母菌(18.5%)和革蘭陰性菌，如大腸埃希菌(29.8%)等。

此外，工業(yè)化生產(chǎn)和分泌藥物相關(guān)蛋白的最佳候選菌株是芽孢桿菌菌株。芽孢桿菌呈棒狀，為好氧或兼性厭氧菌，屬于革蘭陽性菌，已經(jīng)被開發(fā)和構(gòu)建為工業(yè)生產(chǎn)菌株，主要用于天然藥物的生產(chǎn)：一些蛋白酶如堿性蛋白酶(枯草芽孢桿菌)、α-淀粉酶(地衣芽孢桿菌)、β-葡聚糖酶(枯草芽孢桿菌)、抗生素、桿菌肽(地衣芽孢桿菌)，內(nèi)毒素類殺蟲劑(蘇云金芽孢桿菌)，維生素B2(枯草芽孢桿菌)、維生素B12(巨大芽孢桿菌)，多聚γ-谷氨酸補(bǔ)劑或泛醌生物聚合物納米載體(地衣芽孢桿菌)。芽孢桿菌在重組生產(chǎn)藥物相關(guān)蛋白方面的巨大優(yōu)勢，使之在制藥行業(yè)中應(yīng)用廣泛。

與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，芽孢桿菌易培養(yǎng)，生長速度快，培養(yǎng)時(shí)間短；大多數(shù)屬非致病性菌株，不含外毒素、內(nèi)毒素，具有良好的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。在生物制藥領(lǐng)域內(nèi)甚至普遍認(rèn)為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是安全菌株。此外，革蘭陽性菌芽孢桿菌能直接將重組蛋白分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中，下游純化成本更低。相比之下，革蘭陰性菌如研究最多的大腸埃希菌，常常在細(xì)胞內(nèi)積累不溶性蛋白形成包涵體導(dǎo)致細(xì)胞毒性，錯(cuò)誤折疊或二硫鍵缺失的蛋白質(zhì)，都將導(dǎo)致下游加工成本的增高(圖1)。

然而，由芽孢桿菌產(chǎn)生的真核外源蛋白水平比相應(yīng)原核蛋白的水平要低得多，例如分泌的α-淀粉酶濃度為3g/L。產(chǎn)量低的限制因素可能有：與細(xì)胞膜、細(xì)胞壁結(jié)合相關(guān)的蛋白酶由于折疊效率低而被降解；沒有合適的分子伴侶導(dǎo)致前體蛋白質(zhì)折疊成無效構(gòu)象；分泌過量并堆積引起產(chǎn)物抑制導(dǎo)致終產(chǎn)量下降，其過量水平取決于目的蛋白和其他蛋白的分泌水平，如合成與分泌之間復(fù)雜的反饋機(jī)制，其中主要因素為翻譯水平的調(diào)控。為了促進(jìn)重組蛋白高效生產(chǎn)分泌，必須認(rèn)識(shí)、消除這些限制因素。為此，對基因、mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)、代謝物、各通量和調(diào)控水平進(jìn)行系統(tǒng)分析至關(guān)重要。如今，高通量技術(shù)(又稱通量組學(xué)方法)可設(shè)計(jì)構(gòu)建不同的芽孢桿菌菌株，轉(zhuǎn)化為高水平表達(dá)菌株，以此作為大規(guī)模生產(chǎn)藥物相關(guān)蛋白產(chǎn)品的重要載體。

本文調(diào)查了關(guān)于芽孢桿菌生產(chǎn)的藥用重組蛋白的研究現(xiàn)狀，例如高價(jià)值藥物如抗體片段和胰島素前體等。為了進(jìn)一步改進(jìn)芽孢桿菌的重組生產(chǎn)工藝，需要對其進(jìn)行整體觀察，可利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)或通量組學(xué)技術(shù)來研究問題。因此，本綜述的第二部分揭示了系統(tǒng)生物學(xué)和通量組學(xué)技術(shù)的最新發(fā)展，這些技術(shù)是系統(tǒng)地提高重組蛋白產(chǎn)量的有效工具，能將其應(yīng)用于芽孢桿菌菌株生產(chǎn)重組藥物。

2 不同芽孢桿菌菌株重組生產(chǎn)和分泌的藥物相關(guān)蛋白

表1～7總結(jié)了由芽孢桿菌產(chǎn)生的相關(guān)重組蛋白如抗體片段(表1)、人表皮生長因子與人生長激素(表2)、人干擾素和白細(xì)胞介素(表3)、胰島素前體(表4)、青霉素G酰化酶(表5)、葡萄球菌激酶和鏈激酶(表6)，及鏈霉親和素(表7)。

2.1 抗體片段

抗體是醫(yī)學(xué)研究中的重要工具，可與特異性抗原結(jié)合被用于分析、蛋白質(zhì)組研究、疾病的診斷和治療。與抗原具有高親和力的最小常規(guī)抗體片段包括抗原結(jié)合片段(Fab)、單鏈抗原結(jié)合片段(ScFab)和單鏈抗體片段(ScFv)。它們是分別由抗體重鏈和輕鏈組成的抗原結(jié)合區(qū)域和可變結(jié)構(gòu)域組成的異二聚體，通過連接肽連接穩(wěn)定其分子結(jié)構(gòu)。通過重組短芽孢桿菌，可分泌約100mg/L抗人尿激酶型纖溶酶原激活劑Fab，還有研究表明，重組枯草芽孢桿菌也可以產(chǎn)生抗溶菌酶和熒光素的ScFv融合蛋白。通過搖瓶培養(yǎng)重組巨大芽孢桿菌 MS941，能產(chǎn)生390μg/L抗CRP ScFv、410μg/L抗溶菌酶D1.3 ScFv、3.5μg/L結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的D1.3 ScFab。通過重組木糖代謝缺陷的巨大芽孢桿菌YYBm1菌株，D1.3 ScFv在搖瓶中的分泌量可提高至700μg/L，在3L反應(yīng)器中可達(dá)1.5～4mg/L；通過振蕩分批補(bǔ)料培養(yǎng)，D1.3 ScFv的分泌量可達(dá)11.9mg/L；應(yīng)用優(yōu)化的木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，在搖瓶或反應(yīng)器中其分泌量可以達(dá)到7～11mg/L、在微孔板中甚至達(dá)到14±1mg/L。該質(zhì)粒原本設(shè)計(jì)用于在巨大芽孢桿菌中D1.3ScFv的重組生產(chǎn)，后研究表明在地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中也能有效應(yīng)用。在微孔板、搖瓶和生物反應(yīng)器中培養(yǎng)重組地衣芽孢桿菌MW3，分泌量可達(dá)12～17mg/L。重組枯草芽孢桿菌菌株大部分為菌株168的突變體，其蛋白酶基因缺失且胞外蛋白酶活性較低，與野生型相比，產(chǎn)率大大提高。據(jù)報(bào)道3種蛋白酶缺陷型重組枯草芽孢桿菌WB30中抗地高辛的單鏈抗體分泌量為3.5mg/L，6種蛋白酶缺陷的重組枯草芽孢桿菌WB 600中可達(dá)5mg/L。加入合適的分子伴侶，ScFv 產(chǎn)量可以達(dá)到12mg/L。在枯草芽孢桿菌WB800HM [pEPP]菌株中，如果加入分子伴侶，并失活細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶WprA基因，Scfv產(chǎn)量可達(dá)15mg/L。比較重組枯草芽孢桿菌168、WB30和WB600，無論是在微孔板、搖瓶或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，都可發(fā)現(xiàn)蛋白酶分泌較少時(shí)將會(huì)增加ScFv的穩(wěn)定性。由8種蛋白酶基因缺陷型WB800N分泌量可達(dá)132±9mg/L，這是迄今為止已知的革蘭陽性細(xì)菌生產(chǎn)重組抗體片段的最高水平(表1)。

2.2 人生長因子

人表皮生長因子(hEGF)是一種6kDa的多肽，具有3個(gè)二硫鍵，能促進(jìn)表皮和上皮組織的增殖。糖尿病患者通常生長因子濃度偏低，患者可通過注射hEGF治療糖尿病足潰瘍，促進(jìn)傷口愈合。在重組芽孢桿菌HPD31中，hEGF的產(chǎn)量一般可達(dá)到0.24～1.8g/L。在20L攪拌生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)，hEGF產(chǎn)量能達(dá)到1.5g/L。在2種蛋白酶缺陷的重組枯草桿菌DB104中，hEGF分泌量可達(dá)15mg/L(表2)。

人生長激素(hGH)是一種陰離子、非糖基化的四螺旋束蛋白，分子量為22kDa。目前，產(chǎn)自重組大腸埃希菌的hGH可用作治療侏儒癥、損傷、骨折、潰瘍出血和燒傷。芽孢桿菌菌株作為hGH表達(dá)宿主的應(yīng)用：在復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，重組短芽孢桿菌31-OK分泌量可達(dá)240mg/L；缺失中性蛋白酶基因的重組枯草桿菌N325在搖瓶培養(yǎng)可分泌48mg/L的hGH；用重組枯草芽孢桿菌BGSC在分批培養(yǎng)中hGH的產(chǎn)量能達(dá)到70±3mg/L。在1.1～2.4L規(guī)模的生物反應(yīng)器中，采用連續(xù)指數(shù)補(bǔ)料方式，按照特定生長速率，hGH產(chǎn)量甚至能達(dá)到127和497mg/L。

2.3 人干擾素和白細(xì)胞介素

人干擾素是天然防御的信號(hào)蛋白，與特定的受體結(jié)合，可激活抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，用于抗病毒、細(xì)菌、有絲分裂原和腫瘤細(xì)胞。干擾素可用于治療多發(fā)性硬化癥，乙型肝炎，丙型肝炎和癌癥。已有研究闡述了在復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的不同重組枯草桿菌菌株分泌α、β和γ-干擾素的情況：在搖瓶中，使用具有低外源蛋白酶活性的菌株IH6140能分泌1～2U/mL的α-干擾素；SAN 780菌株和Dpr8的α-干擾素的分泌量分別為4.4和14.8± 0.4mg/L；用蛋白酶基因缺陷株GB 500和DB 104分泌15mg/L的α-干擾素；在1.1～1.3L的生物反應(yīng)器中，枯草芽孢桿菌P.amy α-2,6可在分批、連續(xù)培養(yǎng)方法分泌7×104-4×105U/mL；利用重組枯草桿菌N325，能分泌8×10-4U/mL的β -干擾素；還有研究表明，用Drp 3和D8PA菌株，能分泌0.8～1U/mL的β-干擾素、3.9～10.1U/mL的β-干擾素前體。在6種蛋白酶缺陷菌株WB600中，培養(yǎng)上清液中能分泌共表達(dá)20.3±0.8mg/L，200±39μg/L的γ-干擾素(表3)。

人類白細(xì)胞介素是一大類免疫調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白，與細(xì)胞表面的高親和力受體結(jié)合，激活細(xì)胞增殖等復(fù)雜的免疫反應(yīng)如免疫細(xì)胞的成熟、遷移和黏附等。大腸埃希菌中產(chǎn)生的重組白細(xì)胞介素通常與其他藥物聯(lián)合使用進(jìn)行免疫治療，用于治療癌癥或感染。利用復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的重組芽孢桿菌產(chǎn)生白細(xì)胞介素：短芽孢桿菌 HPD 31和31-OK，可分泌高達(dá)120mg/L白介素-2(15.4kDa)、200mg/L白細(xì)胞介素-6(26KDa)。應(yīng)用8種蛋白酶缺陷枯草芽孢桿菌菌株WB 800，能表達(dá)約100mg/L白介素-3(15KDa)(表3)。

2.4 胰島素前體

芽孢桿菌屬的菌株也用于生產(chǎn)前胰島素原和胰島素原(胰島素前體)。前胰島素原是分子量為12kDa，具有3個(gè)二硫鍵的單鏈非糖基化多肽，由C肽與N端信號(hào)肽連接的A鏈和B鏈組成。去除9kDa的信號(hào)肽，可得到胰島素原?？梢酝ㄟ^酶切去除C肽，胰島素原進(jìn)而轉(zhuǎn)化為胰島素，用于治療糖尿病。在20L生物反應(yīng)器中，重組短桿菌HPD 31通過分批培養(yǎng)方法，能生產(chǎn)約50mg/L胰島素原(B鏈(1-29)-A鏈與EGF融合)。使用重組枯草芽孢桿菌AJ 73，LB培養(yǎng)基中胰島素原的分泌量達(dá)165U/mL；在重組枯草桿菌168的孢子表面也能表達(dá)胰島素原；重組枯草桿菌菌株BS273，用固定化細(xì)胞在搖瓶和連續(xù)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)也可得到12.5mg/L大鼠胰島素原；即使是在1.1L最小培養(yǎng)基間歇培養(yǎng)重組枯草芽孢桿菌BB81.3，可分泌870mg/L的胰島素原(表4)。

表1 喬南芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的抗體片段(不完全)

表2 短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的人類生長因子(不完全)

表3 短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的人干擾素和白細(xì)胞介素-2(不完全)

2.5 青霉素G?；?/h3>

青霉素G酰化酶(Pac,EC 3.5.1.11)可催化青霉素G和頭孢菌素G裂解為生產(chǎn)半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要中間體。Pac由一個(gè)小的α亞基(27KDa)和一個(gè)大的β亞基(59KDa)組成，由含有信號(hào)肽和間隔肽的單鏈多肽的前體自身催化生成。在芽孢桿菌屬中，巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌可用于各種表達(dá)系統(tǒng)以及主要是復(fù)合培養(yǎng)基重組生產(chǎn)Pac。突變體中，巨大芽孢桿菌青霉素G?；?BmPac)的生產(chǎn)可高達(dá)20.4U/mL、枯草芽孢桿菌MI 113中達(dá)5.8U/mL；主要胞外蛋白酶、木糖代謝缺陷型菌株巨大芽孢桿菌YYBm1，使用木糖誘導(dǎo)型質(zhì)粒系統(tǒng)，BmPac產(chǎn)量最多可分別達(dá)到47U/mL(微孔板)、1.5U/mL(搖瓶)、1.25U/mL(實(shí)驗(yàn)室攪拌生物反應(yīng)器)?？莶菅挎邨U菌噬菌體Phi105在溫度敏感表達(dá)系統(tǒng)中，搖瓶中分泌2.55U/mL，在連續(xù)生物反應(yīng)器中2.7U/mL，在三相流化床鼓泡塔中可達(dá)4U/mL。采用生物反應(yīng)器中的間歇培養(yǎng)方法，重組的6種蛋白酶缺陷株枯草芽孢桿菌WB 600，糞產(chǎn)堿菌可分泌378U/mL的Pac(AfPac)；具有位點(diǎn)定向突變(BmPacb24F)的菌株可分泌0.92U/mL的BmPac(BmPacb24F)。使用相同的菌株，在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中分泌可高達(dá)1960U/mL的糞產(chǎn)堿菌青霉素G?；?AfPac)。用其它重組枯草桿菌菌株或質(zhì)粒系統(tǒng)，可分泌2.2U/mL的粘節(jié)桿菌青霉素G酰化酶(AvPac)和0.26U/mL或42U/mL的巨大芽孢桿菌青霉素G?；?BmPac)，見表5。

表4 短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的胰島素前體(不完全)

表5 巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的青霉素G酰化酶(不完全)

2.6 葡萄球菌激酶和鏈激酶

葡萄球菌激酶(SAK)是由金黃色葡萄球菌分泌的一種不含二硫鍵的15.5kDa多肽。SAK與纖溶酶原的復(fù)合結(jié)合產(chǎn)生活性纖溶酶，降解血漿蛋白如纖維蛋白。因此，采用重組SAK作為溶栓藥物治療急性心肌梗死和預(yù)防血栓形成。已有研究表明重組蛋白酶缺陷型枯草芽孢桿菌在復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SAK分泌情況；2種酶基因缺陷菌株DB 104，表達(dá)約25mg/L的SAK；7種蛋白酶基因缺陷菌株WB700和LB700，分泌可增加至120和181mg/L；WB700菌株在生物反應(yīng)器中采用分批補(bǔ)料法，產(chǎn)率進(jìn)一步提高到255和337mg/L(表6)。

SAK僅在纖維蛋白誘導(dǎo)時(shí)活化纖溶酶原，SEK則能在纖維蛋白及液相中均可活化纖溶酶原(非纖維蛋白特異性)。分子量為47kDa的鏈激酶最初由幾種鏈球菌產(chǎn)生，同樣用于治療急性心肌梗死和血栓形成。來自于鏈球菌的鏈球菌屬枯草桿菌GSB26可分泌150U/mL的SEK；枯草芽孢桿菌168和蛋白酶基因缺陷菌株DB194、WB428、WB500和BB600也可用于SEK生產(chǎn)(表6)。

2.7 鏈霉親和素

鏈霉親和素(SAV)是一類由阿維丁鏈霉菌產(chǎn)生的胞外四聚體蛋白，分子量約60kDa。SAV每個(gè)亞基都具有生物素結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合具有高度特異性，因此，SAV被廣泛應(yīng)用于多種診斷性檢測，具有靶向治療的潛力。使用2種蛋白酶缺陷型枯草芽孢桿菌BE1510，在復(fù)合培養(yǎng)基中SAV的分泌量可達(dá)30～50mg/L，使用8種蛋白酶缺陷型芽孢桿菌WB800分泌量達(dá)35～50mg/L。使用7種蛋白酶缺陷型芽孢桿菌WB700SpoⅡG，采用半組合培養(yǎng)基與復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)方法分泌量分別達(dá)到24mg/L和90mg/L。同時(shí)使用8種蛋白酶缺陷型WB800菌株還能夠產(chǎn)生其他不同類型的SAV(表7)。

3 系統(tǒng)生物學(xué)及其最新發(fā)展

為探究生物機(jī)體整個(gè)系統(tǒng)、重組蛋白在細(xì)胞中的生產(chǎn)過程并優(yōu)化，需要采用精確的定量分析方法對整體進(jìn)行研究，因此需要同時(shí)記錄機(jī)體的不同組分(基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、代謝物、代謝途徑等)的情況。然而，生命不是靜態(tài)的，了解機(jī)體的整體調(diào)控網(wǎng)路、協(xié)調(diào)它們在體內(nèi)的相互作用以及探究不同生物成分是如何在一個(gè)整體發(fā)揮作用是很重要的。為此，系統(tǒng)生物學(xué)作為一門整合性科學(xué)產(chǎn)生了，它將經(jīng)典生物學(xué)研究方法結(jié)合多門學(xué)科、利用信息學(xué)方法，評(píng)估機(jī)體各組分的相互作用和動(dòng)態(tài)調(diào)控。

生物系統(tǒng)與其功能的研究需要高通量組學(xué)技術(shù)和先進(jìn)計(jì)算方法的支持，實(shí)現(xiàn)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得和處理。為了探究生物體的整體調(diào)節(jié)，系統(tǒng)生物學(xué)以多種方式系統(tǒng)地干擾生物體，記錄不同水平下的變化：包括基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄組)，蛋白質(zhì)生產(chǎn)(蛋白質(zhì)組學(xué))，代謝物的修飾(代謝組學(xué))，通路間的相互作用(通量組學(xué))。將收集的數(shù)據(jù)整合起來，代入已知或假設(shè)的計(jì)算模型中，有助于其迭代精煉。將生成的數(shù)據(jù)和潛在的生物相互作用建立數(shù)據(jù)庫，對未發(fā)現(xiàn)的代謝途徑、遺傳信息和相互作用模式進(jìn)行索引，用于研究潛在瓶頸以期達(dá)成目標(biāo)。

系統(tǒng)生物學(xué)的另一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)是自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化遺傳工具的迅速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了快速測序、基因敲除、插入或誘變。此后，通過改變非生物條件或針對性地改變生物體的內(nèi)在作用，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)干擾用于研究特定的調(diào)節(jié)途徑。盡管在計(jì)算精密度和覆蓋度等方面仍存在一些挑戰(zhàn)，系統(tǒng)生物學(xué)已經(jīng)在許多方面擴(kuò)展了細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)知識(shí)，可以有效收集并處理這些組學(xué)數(shù)據(jù)。能否克服這些挑戰(zhàn)很大程度上取決于其他研究領(lǐng)域如計(jì)算機(jī)科學(xué)、生化工程、物理學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的突破。

表6 枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的葡萄球菌激酶和鏈激酶(不完全)

表7 枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的鏈霉親和素(不完全)

總之，系統(tǒng)生物學(xué)是一門很有前景的學(xué)科，在學(xué)術(shù)研究和工業(yè)應(yīng)用方面都能得到廣泛應(yīng)用，例如可應(yīng)用于芽孢桿菌研究。受試菌能夠幫助預(yù)測遺傳操縱和誘導(dǎo)的代謝干擾等如何影響表型，例如重組蛋白的生產(chǎn)分泌和副產(chǎn)物的形成。因此，它還將在改進(jìn)芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)抗體片段、生長因子或激酶等重組生物藥物方面發(fā)揮重要作用。通過系統(tǒng)生物學(xué)方法，不用隨機(jī)誘變，通過合理設(shè)計(jì)新型工業(yè)微生物就能生產(chǎn)高產(chǎn)量的相關(guān)蛋白質(zhì)，簡化培養(yǎng)條件，避免產(chǎn)生不必要的副產(chǎn)物。最后，重組芽孢桿菌菌株可以成為經(jīng)遺傳改造以適應(yīng)生產(chǎn)過程的先驗(yàn)菌株。

3.1 基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)

根據(jù)過去30年來測序技術(shù)的快速發(fā)展，基因組測序變得更便利。對用于生產(chǎn)的芽孢桿菌菌株進(jìn)行測序，尤其是用于生產(chǎn)重組蛋白的菌株，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。隨著每個(gè)月就能完成一個(gè)新的細(xì)菌基因組的完全測序，生物研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代，將收集到的遺傳信息轉(zhuǎn)化為遺傳功能用于描述微生物的動(dòng)態(tài)過程。對細(xì)胞在特定生理?xiàng)l件下存在的整套轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行定性及定量被稱為轉(zhuǎn)錄組學(xué)，它是獲得新的基因的功能和調(diào)節(jié)的有效方法。從發(fā)展歷程看，基因表達(dá)首先是用Northern雜交方法進(jìn)行分析，包括電泳和標(biāo)記互補(bǔ)探針雜交；隨后，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)將mRNA轉(zhuǎn)化為其互補(bǔ)DNA(cDNA)實(shí)現(xiàn)了定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)的發(fā)展。qRT-PCR是目前最靈敏的RNA定量技術(shù)，然而，qRT-PCR是一種基因特異性方法，在基因組規(guī)模上監(jiān)測基因表達(dá)水平需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力。

約30年前發(fā)展起來的DNA微陣列技術(shù)提供了簡單可靠的方法，能識(shí)別、量化多達(dá)數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)水平。這是在一項(xiàng)針對枯草芽孢桿菌的全面研究中實(shí)現(xiàn)的，該研究涉及到生物體在自然界和蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中可能受到的各種不同條件的影響。然而，微陣列存在一些缺點(diǎn)，它僅限于給定的探針而不能捕捉整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性。這些DNA探針可能存在交叉雜交，如出現(xiàn)類似于目標(biāo)序列的轉(zhuǎn)錄本會(huì)影響信號(hào)可靠性。此外，實(shí)驗(yàn)設(shè)置也會(huì)影響結(jié)果，計(jì)算是相對的，動(dòng)態(tài)范圍受信號(hào)飽和的內(nèi)在限制和背景噪聲的限制。最重要的是，這項(xiàng)技術(shù)依賴于正在調(diào)查的基因組序列的知識(shí)，因此并不普遍適用于非模式生物或特定菌株，例如用于生產(chǎn)重組蛋白的菌株芽孢桿菌。因此，RNA-seq，一種最近發(fā)展起來的基于下一代測序技術(shù)的高通量技術(shù)，克服了大部分限制，并預(yù)計(jì)未來幾年將優(yōu)于微陣列技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)已用于分析不同枯草桿菌mRNA的衰變。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)

雖然轉(zhuǎn)錄組分析給出了在特定環(huán)境條件下基因表達(dá)的全面概述，檢測到的mRNA轉(zhuǎn)錄子只是基因和蛋白質(zhì)之間的中間產(chǎn)物。相反，蛋白質(zhì)承擔(dān)從催化到基因調(diào)節(jié)的大部分細(xì)胞功能，包括核苷酸和氨基酸循環(huán)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。但由于轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)和蛋白酶的活性，很難從轉(zhuǎn)錄水平推斷它們的濃度，必須用專門的方法測定它們的濃度。

蛋白質(zhì)組學(xué)為了解決這一問題，開發(fā)新的分析和計(jì)算技術(shù)，以檢測、識(shí)別和量化給定樣本中的整套蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍還包括翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)定位、相互作用和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)表征，充分研究它們的生物學(xué)功能。經(jīng)過詳細(xì)研究表明，現(xiàn)有的分離和定量技術(shù)方法是可用的。通常，通過1D/2D十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳法根據(jù)其摩爾質(zhì)量(MM)和等電點(diǎn)(pI)分離蛋白質(zhì)，染色；后經(jīng)凝膠成像定量后，用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性。在重組蛋白生產(chǎn)過程中，對枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，解決因素，構(gòu)建工程菌株。在現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)中，人們越來越關(guān)注使用非凝膠色譜分離技術(shù)和基于質(zhì)譜(MS)的定量方法，而凝膠電泳主要是作為初步分離步驟，降低蛋白質(zhì)或多肽的復(fù)雜程度更利于分析。

自1919年阿斯頓發(fā)明了第一種質(zhì)譜儀以來，已經(jīng)取得了大量的進(jìn)步，并采用了如矩陣輔助激光解吸/電離(MALDI)和電離等軟離子化如噴霧電離(ESI)等方法能測定完整的蛋白質(zhì)和多肽。然而，對未損壞蛋白質(zhì)的直接分析仍然具有較大挑戰(zhàn)，測定其組成多肽的仍然是蛋白質(zhì)分析的有效方法。在芽孢桿菌菌株研究方法中，目前除了蛋白質(zhì)鑒定之外，對MS蛋白質(zhì)組學(xué)和計(jì)算方法的改進(jìn)已經(jīng)可以做到相對和絕對定量。

3.3 代謝組學(xué)

自基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被引入，已被成功地結(jié)合起來，得到生物系統(tǒng)功能的新認(rèn)識(shí)。然而，這種組合也迅速顯現(xiàn)其限制性，代謝產(chǎn)物的研究則能彌補(bǔ)基因組與其表型之間的鴻溝。測序的基因組通常包括30%～40%的編碼具有未知功能的蛋白質(zhì)的基因，或不考慮微小的構(gòu)型差異可能帶來的潛在生化意義，根據(jù)基因相似結(jié)構(gòu)自動(dòng)歸屬生化功能。而且，雖然代謝物庫在很大程度上取決于酶的濃度和活性，但細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體和蛋白質(zhì)組變異不一定會(huì)導(dǎo)致表型改變，說明存在較強(qiáng)的翻譯后調(diào)控機(jī)制。由于代謝產(chǎn)物進(jìn)一步連接從基因組到表型和所有合成代謝和分解代謝反應(yīng)，因此代謝產(chǎn)物很自然地作為下一步研究，以揭示新的基因功能、相互作用、代謝途徑和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。Buescher等系統(tǒng)地分析枯草芽孢桿菌在相應(yīng)環(huán)境變化過程中的代謝產(chǎn)物。

生物體在給定的生理?xiàng)l件下合成的所有代謝物構(gòu)成其代謝組。對生物體而言，它可包含多達(dá)200000種代謝物，其化學(xué)性質(zhì)和濃度(從皮摩爾每升到毫摩爾每升)差異很大。這種多樣性可獲得非常豐富的信息，但同時(shí)也使所有代謝物的鑒定和定量，即代謝組學(xué)，成為現(xiàn)代生物化學(xué)的最大的挑戰(zhàn)之一。代謝物指紋圖譜的目的是對不同的樣品進(jìn)行分類，而不對代謝物進(jìn)行定量、鑒別甚至分離，只用它們的特征測量譜作為判別標(biāo)準(zhǔn)。最后，代謝分析旨在對不同的代謝組定性和定量，例如氨基酸、碳水化合物或參與特定途徑的那些代謝物，并理解它的生化作用。

3.4 通量組學(xué)

在細(xì)胞中，代謝物通過復(fù)雜、重疊的途徑不斷轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物，最終產(chǎn)生能量和活性物質(zhì)?；蚪M、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組之間所有非線性調(diào)節(jié)和代謝相互作用的最終途徑是通過這些代謝通量(即生化轉(zhuǎn)化率)之間多樣的調(diào)控展現(xiàn)出來的。這些通量均可表征機(jī)體的細(xì)胞生理方面和可觀測外在的表型。所有的代謝通量都直觀地展現(xiàn)了系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)，而其他組學(xué)數(shù)據(jù)則為解釋這些結(jié)論提供了必要的基礎(chǔ)。通量組學(xué)與其他組學(xué)技術(shù)的互補(bǔ)，充分顯示了調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，并表明轉(zhuǎn)錄后和翻譯后的影響。有趣的是，在最近的研究中，基于轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)中的通量數(shù)據(jù)的實(shí)際分布和預(yù)測之間存在嚴(yán)重差異。通過對枯草芽孢桿菌適應(yīng)限制營養(yǎng)和滲透變化過程中轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組和通量組的分析，提出了一種多功能分析方法，Kohlstedt等在該研究中提供了大量數(shù)據(jù)，展現(xiàn)了高超的生物技術(shù)水平。

代謝通量分析已經(jīng)是一種成熟的技術(shù)，到目前為止，與其他經(jīng)濟(jì)學(xué)方法相比，它在研究和工業(yè)生產(chǎn)中都被大大低估，無法得到充分利用。它的實(shí)際應(yīng)用范圍只限于驗(yàn)證引入的遺傳修飾的益處，例如分析突變株或提高重組蛋白在不同芽孢桿菌中的產(chǎn)量。相反，應(yīng)該將其更廣泛地應(yīng)用于上游基因設(shè)計(jì)。應(yīng)用合理的方法減少硅制品的使用，降低因副產(chǎn)物分泌增加、生長緩慢或細(xì)胞死亡等改變而產(chǎn)生的意外和有害的副作用，即所謂的降低了生產(chǎn)力。

在過去的十年里，一些研究進(jìn)一步證實(shí)了通量組學(xué)在揭示芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的非常規(guī)優(yōu)化和克服其限制因素中的極大的潛力。例如，一方面，組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于增加枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌中蛋白質(zhì)和維生素的產(chǎn)量；另一方面，最近的一些研究揭示了通量組學(xué)在發(fā)現(xiàn)新途徑或?yàn)橐阎吠卣剐碌纳锕δ芊矫娴臐摿Γ怪蔀榘l(fā)現(xiàn)生物的整體復(fù)雜性的不可或缺的工具。

4 前景展望

系統(tǒng)生物學(xué)工具在芽孢桿菌基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組中的應(yīng)用及整體優(yōu)化是提高重組蛋白產(chǎn)量的有效方法。系統(tǒng)生物學(xué)的思想是沿著現(xiàn)有方法，如在芽孢桿菌中構(gòu)建新的基因，探究其編碼蛋白質(zhì)及代謝和信號(hào)途徑。我們已經(jīng)進(jìn)行了第一次嘗試：例如，根據(jù)目的蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，可以從枯草桿菌啟動(dòng)子庫中選擇合適啟動(dòng)子；同樣，也可以通過選擇不同的信號(hào)肽，調(diào)節(jié)重組蛋白的分泌途徑和分泌水平。就像啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列設(shè)計(jì)是進(jìn)一步合成更復(fù)雜的DNA結(jié)構(gòu)的第一步，那么將多種芽孢桿菌表達(dá)、轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相結(jié)合，生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)也是可能的。為了全面優(yōu)化芽孢桿菌系統(tǒng)，研究表明通過核糖體工程、人工分泌途徑和基因組縮減等方法，能顯著提高重組蛋白的產(chǎn)率。

5 結(jié)束語

近年來，芽孢桿菌在生產(chǎn)和分泌重組蛋白方面得到越來越廣泛的應(yīng)用，主要得益于高效表達(dá)系統(tǒng)的快速發(fā)展。芽孢桿菌生產(chǎn)的重組藥物產(chǎn)品種類繁多，包括抗體片段、生長因子、干擾素和白細(xì)胞介素、胰島素前體、青霉素G酰化酶、鏈霉親和素、葡萄球菌激酶和鏈激酶等。因此，芽孢桿菌逐漸成為重要工業(yè)生產(chǎn)用菌。為提高芽孢桿菌生產(chǎn)分泌能力，必須明確其生化過程中調(diào)控機(jī)制及其主要遺傳特性。因此，應(yīng)在不同研究水平對芽孢桿菌菌株進(jìn)行研究，即在不同培養(yǎng)條件下，從基因組學(xué)到轉(zhuǎn)錄組學(xué)，從蛋白質(zhì)組學(xué)到代謝組學(xué)和通量組學(xué)中的不同特征進(jìn)行探究。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，近期發(fā)展起來的系統(tǒng)生物學(xué)和組學(xué)技術(shù)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和通量組學(xué))成為必不可少的工具?？傊?，面向系統(tǒng)整體的研究方法才剛剛起步，芽孢桿菌的生產(chǎn)潛力是巨大的，因?yàn)榻M學(xué)工具和建模方法已在藥學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，而應(yīng)用于芽孢桿菌的實(shí)例卻寥寥無幾。未來，為使重組芽孢桿菌更高效地生產(chǎn)藥物，組學(xué)技術(shù)應(yīng)更多地用于發(fā)現(xiàn)并解決現(xiàn)行生產(chǎn)中的瓶頸，優(yōu)化工藝達(dá)到目標(biāo)。