白海英,溫 靜,王 丹,張偉華

(1.山西醫(yī)科大學，太原030000； 2.山西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,太原 030000)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一組起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，其病因復雜，異質(zhì)性大，預后及長期生存率較差[1-2]。隨著新的化療方案的應用，超過80%的初診患者在強化誘導化療后可獲得完全緩解，但大部分患者會再次復發(fā)，尤其是老年患者[3-4]。因此，預防或降低緩解后復發(fā)對于AML的預后至關(guān)重要。主動免疫是當今治療AML的熱點。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)因其特有的捕獲抗原和呈遞抗原的能力，在激活機體T細胞免疫系統(tǒng)后，可進一步減少或殺傷微小殘留病灶[5-6]，從而減少復發(fā)，延長患者生存時間，有望成為治療AML的最佳方法?，F(xiàn)就DC疫苗在AML免疫治療中的作用予以綜述。

1 DC的生物特性

DC起源于造血干細胞,廣泛分布于機體各組織和器官,根據(jù)其來源可分為髓系DC和淋巴系DC，在體內(nèi)以髓系DC為主[7],而髓系DC需經(jīng)分化才具備特有功能。首先，前體細胞分化為未成熟DC，處于該階段的細胞具有極強的抗原攝取能力，主要是誘導免疫耐受，是人體正常情況下的主要存在形式；其次，在各種因素的影響下未成熟DC進一步分化為成熟DC，其攝取抗原的能力明顯降低，激活T細胞的能力和呈遞抗原的能力顯著增強，能夠誘導Fas淋巴細胞凋亡，從而參與免疫應答調(diào)控。

DC是引發(fā)細胞免疫和體液免疫的重要介導者[8]。DC是目前已知的人體內(nèi)功能最強大且唯一能激活靜息期T細胞的專職抗原呈遞細胞，其能夠直接激活體內(nèi)CD4+輔助性T細胞(T helper cells，Th)和CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，同時可以使B細胞產(chǎn)生抗體。因此，T細胞免疫有望在清除微小殘留病變中發(fā)揮重要作用[9]。當機體發(fā)生腫瘤時，免疫系統(tǒng)通過監(jiān)視功能識別突變或異常表達的腫瘤相關(guān)抗原，由DC識別并將腫瘤抗原加工成與主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)相結(jié)合的抗原肽，形成MHC-抗原肽復合物，作為T細胞活化的第一信號，同時與T細胞表面高表達的CD80、CD40等黏附分子相結(jié)合，進而提供T細胞活化的第二信號，激活T細胞，產(chǎn)生抗腫瘤的免疫應答反應[10-11]。

2 DC與AML免疫

AML難治、易復發(fā)的原因可能與白血病細胞抑制免疫系統(tǒng)的識別和激活有關(guān)，如抑制DC的分化成熟，誘導其凋亡、分泌抑制性細胞因子如白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1等。白血病細胞還能使MHC、共刺激分子等表達減少，且機體不存在抗AML系統(tǒng)，因此特異性T細胞無法檢測和識別抗蛋白酶3、細胞特異抗原等，從而使腫瘤細胞發(fā)生逃逸[12]。因此，針對機體免疫系統(tǒng)的治療成為當前血液系統(tǒng)疾病治療的新方向。在大部分AML患者中，程序性死亡受體配體1(programmed death receptor ligand 1,PD-L1)呈過表達，而PD-L1是免疫系統(tǒng)重要的負調(diào)節(jié)分子，其對T細胞的活化產(chǎn)生抑制性信號[13],下調(diào)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-2磷酸酶信號，導致腫瘤細胞逃逸[14]。成熟的DCs是PD-L1表達的負性調(diào)控因素，體外修飾DC可以降低PD-L1的表達，提高共刺激分子以及細胞因子的表達，從而顯著增強T細胞的抗腫瘤免疫能力[15]。

3 AML患者中的DC及功能

在大部分初診AML患者中，髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cell，mDC)和漿樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)減少，小部分升高或正常。DC起源于造血干細胞，與單核細胞共同由前體細胞分化而來，在正常情況下DC處于平衡狀態(tài)，當機體微環(huán)境或基因發(fā)生突變時，DC也隨之發(fā)生改變[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MS樣的酪氨酸激酶3基因內(nèi)部串聯(lián)重復序列(FMS-like tyrosine kinase 3 internal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD)突變陽性的AML患者中，mDC和pDC的含量明顯高于FLT3-ITD突變陰性者，且從FLT3-ITD陽性的AML患者中分離出來的mDC和pDC的FLT3-ITD突變同樣為陽性[17]。另外有學者發(fā)現(xiàn)，完全緩解后的AML患者外周血中也存在前體DC，但白血病相關(guān)標志為陰性[18]。由此可見，在AML患者中白血病相關(guān)DC明顯增多，正常DC減少。

在AML患者中，骨髓是不成熟DC捕捉AML抗原的主要部位，且捕捉能力受AML細胞本身因素和細胞因子的影響。AML細胞可以表達某些抑制基因，抑制細胞免疫的激活、促進調(diào)節(jié)性T細胞形成，從而使大量調(diào)節(jié)性T細胞聚集。同時，AML細胞能抑制正常細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原-4的表達，使機體T細胞免疫識別和殺傷功能異常或減低[19]。成熟DC在AML中具有呈遞抗原和激活CTL反應的作用。體外培養(yǎng)獲得的DC可以誘導出針對白血病相關(guān)抗原如Wilms瘤基因1(Wilms′tumor gene 1,WT1)蛋白的特異性CTL反應，而Bcr/abl肽轉(zhuǎn)染或孵育的DC和FLT3-ITD陽性的DC產(chǎn)生的是針對受Bcr/abl和FLT3-ITD調(diào)節(jié)的抗原特異性CTL反應[20]。說明不同方式獲得的DC有特定的免疫誘導作用。

4 DC在AML中的作用及來源

4.1DC誘導活化T細胞免疫機制 DC是唯一能激活靜息狀態(tài)下T細胞的細胞，并能夠為T細胞活化提供所需的所有信號[21]。T細胞必須在3個活化信號的共同作用下才能達到最佳免疫效應[19]。第一信號是MHC分子與T細胞受體結(jié)合；第二信號是DC表達的CD80和CD86與T細胞表達的CD28受體相互作用，形成共刺激分子；第三信號則直接激活體內(nèi)的CD4+Th細胞和CD8+CTL。Th細胞的免疫應答在免疫治療中起重要作用，而IL-12是控制Th1極化的重要細胞因子，可由DC特異性釋放。

4.2DC的來源

4.2.1白血病DC 臨床上常用的白血病DC有兩種：一種是自體白血病DC，另一種是異體白血病DC[19]。自體AML-DC是從白血病患者自身中獲得，其保留了由自體起源的白血病細胞表達的整個白血病相關(guān)抗原譜。因此，AML-DC具有誘導針對廣譜白血病相關(guān)抗原自體起源的白血病細胞的抗白血病免疫潛力，而無需抗原鑒定或外源性細胞抗原的加載[8]。雖然理論上這種方法可行，但實際上有諸多限制：①獲取AML-DC疫苗的技術(shù)有一定的局限性，雖然近年來體外培養(yǎng)AML-DC的實驗及方案較多，但仍需進一步成熟；②在AML-DC疫苗細胞培養(yǎng)過程中，無法確保正常成熟表型的正常表達，同時不能準確控制AML-DC的數(shù)量；③在體外培養(yǎng)過程中，無法完全模擬AML-DC需要的微環(huán)境，因此可能會出現(xiàn)DC功能紊亂的現(xiàn)象。盡管現(xiàn)實中有眾多不可控因素，但未來AML-DC的發(fā)展仍有較大空間。

4.2.2正常DC 由單核細胞分化而來的DC(monocytes-derived dendritic cell，mo-DC)是目前臨床腫瘤免疫治療常用的DC類型[22]。在外周血循環(huán)中，單核細胞約占白細胞總數(shù)的10%，因此可以通過白細胞分離術(shù)和單核細胞分離術(shù)獲得大量的mo-DC。在造血干細胞移植過程中，患者獲得完全緩解后，可采用粒細胞集落刺激因子動員血細胞正常分化并進行采集mo-DC。同理，非AML-DC也可以用于臨床。有研究發(fā)現(xiàn)，非AML-DC較AML-DC有明顯優(yōu)勢，但非AML-DC需要進行抗原修飾，如加入外源肽、白血病細胞裂解物、干擾白血病細胞合成的信使RNA(messenger RNA，mRNA)編碼基因等，進而發(fā)揮刺激T細胞活化、增強免疫識別、殺傷和破壞白血病細胞的作用[19]。

4.2.3外周血DC 外周血指標可直觀反映機體的生理變化，因此外周血中的DC最有可能成為機體生理來源的DC的代表[23]。外周血DC可通過粒細胞集落刺激因子動員AML患者的外周血獲得，但在功能上可能有明顯欠缺[24]。因此，對于外周血DC疫苗的應用仍需進一步探討。

5 AML的DC疫苗

5.1CD34+-DC CD34+-DC是最早應用于臨床的同種異體DC疫苗。2001年Fujii等[25]首次在造血干細胞移植復發(fā)患者中嘗試使用同種異體CD34+-DC,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者有延遲超敏反應發(fā)生，證明同種異體CD34+-DC可誘發(fā)T細胞介導的免疫反應。為了進一步證實CD34+-DC的作用，Balan等[26]采集了正常人的臍帶血，采用分離、體外培養(yǎng)等方法獲得大量CD34+-DC,通過不同的修飾方法得到XCR1+-DC和XCR1-CD34+-DC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XCR1+CD34+-DC有更加特異地刺激機體T細胞免疫的功能，同時能夠調(diào)控眾多表達DC的基因，選擇性高表達抗細胞凋亡基因、抗病毒基因以及作用于自然殺傷細胞或T細胞的細胞因子/趨化因子,證明CD34+-DC能提高機體免疫力，有望進一步應用于臨床。從造血干細胞或造血祖細胞中分離、提取的CD34+-DC[1]，通過優(yōu)化其分化過程的mRNA序列加工、增強MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ呈遞以及敲除分化過程中潛在抑制免疫基因等增強抗腫瘤免疫反應，有望成為當前預防異基因造血干細胞移植后復發(fā)的有效治療方案。

5.3Th1-極化DC Th1-極化DC是在體外培養(yǎng)單核細胞DC的第3天，通過加入含有Toll樣受體7/8激動劑R848、Toll樣受體3配體poly(I：C)以及TNF-α、IL-1β、γ干擾素以及前列腺素E2等細胞因子的混合物，促使特異性DC分化得到的，與常規(guī)標準7 d獲得的DC相比，Th1-極化DC對抗原的攝取、呈遞以及刺激特異性T細胞的能力一致，但共刺激分子CD80和CD86的表達率更高[30]。DCs激活抗腫瘤免疫應答的能力高度依賴于其分泌炎癥細胞因子的能力。IL-12p70在CD4+細胞極化為Th1細胞反應方向的應答中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31]，而CD4+Th1細胞又可刺激或誘導具有特異性殺死腫瘤細胞功能的CD8+CTL活化，Toll樣受體7/8激動劑復合物在誘導DC分化過程中明顯刺激DC高表達IL-12p70[29]。此外，IL-12p70在自然殺傷細胞的活化過程中也具有重要作用，進而起到多環(huán)節(jié)加強機體抗腫瘤效應。在成功獲取功能完整、性質(zhì)穩(wěn)定的DC后，通過電穿孔法對其進行不同抗原負載，如WT1、PRAME(優(yōu)先表達黑素瘤中的抗原)等，進而得到具有不同功能及抗原特異性的新型疫苗，并已在小鼠模型中成功驗證誘導T細胞免疫的作用是有效的[32]。Th1-極化DC已經(jīng)入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，但結(jié)果尚未公布。

5.4DCP-001 DCP-001[33]是一種新型的DC疫苗，該類疫苗不僅具有同種異體DC的相關(guān)免疫作用，而且還保留了AML相關(guān)抗原表達的能力。DCP-001的制備過程可控，性質(zhì)穩(wěn)定，臨床上可安全制備。在米托蒽醌類藥物的存在下，將細胞在含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、TNF-α以及IL-4的混合物中培養(yǎng)以加速DC分化，然后加入前列腺素E2、TNF-α和IL-1β促進成熟，嚴格把握DC成熟后的質(zhì)量控制，并根據(jù)其免疫表型以及對T細胞活化的刺激反應方向和能力等進行分類。該類疫苗作用可靠、療效安全，已進行Ⅰ期臨床試驗。國外有研究對12例誘導緩解的老年AML患者分別在第0天、第14天、第28天以及第42天使用了DCP-001疫苗，在治療開始前和治療結(jié)束后監(jiān)測機體免疫反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎所有患者的T細胞免疫和腫瘤免疫應答增強，患者的總體生存時間延長，其中1例在治療后36個月仍存活，說明DCP-001疫苗有強大的抗白血病及免疫介導作用，可用于AML的治療[31]。隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，DC疫苗在AML的治療中將會有新的突破。

6 問題與展望

隨著人類對AML發(fā)病機制的不斷認識以及醫(yī)學的發(fā)展，尋求緩解AML更好的方法、延長患者生命不再是臨床治療的最終目標，而徹底治愈AML已成為當前治療的終極目標。免疫治療技術(shù)的成熟、DC疫苗免疫作用的明確以及化療與DC免疫組合療法的應用[34]給治愈AML提供了新方向。但目前疫苗的制備仍有一定困難，存在疫苗生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)費用昂貴、數(shù)量少、無法穩(wěn)定生產(chǎn)等問題。同時，DC疫苗尚處于臨床試驗階段，選取的患者均為復發(fā)難治或傳統(tǒng)方法無法挽救的患者，到目前為止暫無初診患者使用DC治療的報道，這對于DC疫苗的臨床效果研究有一定的影響。對于DC疫苗仍需完善制備技術(shù)，探索新的功能，探討AML的發(fā)病機制以及與DC間的相互作用，以期為更好地治療AML奠定基礎(chǔ)。