白 潔,英子偉，趙 林，李偉杰，王 聰，謝賢鑫，姜大慶

0 引言

隨著化療藥物及靶向治療藥物的研發(fā),乳腺癌患者的總生存率及復發(fā)率均有一定程度的提高[1],但是化療耐藥仍然是影響乳腺癌患者復發(fā)率及總生存期的最主要因素,最終導致治療減效、無效及失敗[2-3]。多西他賽(Docetaxel，Doc)在乳腺癌、胃癌及非小細胞肺癌等腫瘤中是最主要的化療藥物，為新一代紫杉類抗癌藥，是有絲分裂抑制劑[4-8]。多西他賽與希羅達、順鉑及表柔比星等藥物聯(lián)合化療在晚期乳腺癌化療中發(fā)揮重要的作用[9-11]。多種miRNA在乳腺癌中為高表達，通過作用于靶基因調(diào)控多種惡性腫瘤細胞的增殖及凋亡等惡性行為，并與化療耐藥具有相關性[12]。有研究顯示，miR-21對乳腺癌細胞增殖具有重要調(diào)控作用，Tumor-suppressor genes programmed cell death 4 (PDCD4)是miR-21的靶基因[13-14]。本研究通過Targetscan等靶基因預測分析軟件，進一步對miR-21與PDCD4的靶向調(diào)控關系進行了預測分析，觀察miR-21表達對Doc耐藥乳腺癌細胞株存活的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株HCC1937購自中科院上海細胞庫，通過Doc劑量階梯遞增方法建立穩(wěn)轉(zhuǎn)Doc耐藥HCC1937/Doc細胞株，在中國醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院(遼寧省腫瘤醫(yī)院)中心實驗室培養(yǎng)傳代。miR-21-5p mimics、miR-21-5p inhibitor、control mimics及control inhibitor購自英國Cohesion Biosciences公司,PDCD4多克隆抗體購自美國Sigma公司。miRNA提取及分離試劑盒、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，MTT試劑盒及All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒購自美國Abcam公司。大連寶生生物技術有限公司對引物設計及合成,miR-21-5p forward:5′-CGTTGAATGTCACTCTGGTG-3′;reverse:5′-GGTCATTGTGTGCAGCTCAC-3′。GAPDH forward:5′-GGAGTGAGATCGAAGTGGC-3′;reverse:5′-GAGGATGATGATTAGTGGTC-3′。

1.2 轉(zhuǎn)染試驗 對數(shù)生長期HCC1937及HCC1937/Doc細胞消化為單細胞懸液，以20×104/孔細胞接種于24孔板，依據(jù)Lipo2000說明書對達到70%融合度的細胞株轉(zhuǎn)染(miR-21-5p mimics、miR-21-5p inhibitor、control mimics及control inhibitor)，轉(zhuǎn)染過程完成后繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后qRT-PCR進行轉(zhuǎn)染效率檢測，準備進行下一步實驗。

1.3 細胞生存率分析 將轉(zhuǎn)染后的HCC1937/Doc及HCC1937細胞以8×103/孔的濃度加入96孔板,以0.05、0.5、5、50 μmol/L濃度梯度歸于Doc處理48 h，以MTT試驗分析細胞增殖率。加入5 mg/ml濃度的MTT液2 ml/孔，溫育條件下放置4 h后棄上清，加入二甲基亞砜150 μl進行振蕩以溶解結晶，以550 nm的波長用酶聯(lián)免疫檢測儀進行吸光度測定，獨立實驗重復3次，對平均值進行分析。

1.4 qRT-PCR 取擬進行試驗的HCC1937/Doc及HCC1937細胞，總RNA提取及純化依照Trizol試劑操作說明進行，分別以紫外吸收法和變性瓊脂糖凝膠電泳法對RNA的質(zhì)量及完整性進行檢測。依次進行合成樣品cDNA，采用qRT-PCR測定梯度稀釋的標準品包括待測樣品的管家基因，然后進行梯度稀釋標準曲線的DNA模板繪制，qRT-PCR步驟測定待測基因，配制完成的PCR反應液上RT-PCR，PCR擴增反應。ΔΔCt法分析溶解曲線。

1.5 Western blot 對擬進行實驗的HCC1937/Doc及HCC1937細胞預處理，對蛋白的濃度進行定量。對蛋白進行裂解后震蕩搖勻，對總蛋白進行抽提操作，取上清液，采用BCA定量試劑盒對蛋白濃度進行定量分析。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用5%脫脂奶粉在室溫條件下進行90 min封閉后加Ⅰ抗，孵育12 h后加入Ⅱ抗，ECL進行顯色。β-actin是內(nèi)參照。以軟件Quantity One進行灰度值的分析，結果以蛋白相對表達量=灰度值(目標蛋白)/灰度值(內(nèi)參照蛋白)進行表示及統(tǒng)計。

2 結果

2.1 miR-21-5p調(diào)控HCC1937細胞對Doc敏感性 miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，結果顯示，與對照組比較，miR-21-5p在HCC1937細胞中表達為對照組的212倍(P<0.05)，Doc的ICD50(1.98±0.16)μmol/L明顯高于NC組(0.78±0.06)μmol/L及control mimics組(1.08±0.17)μmol/L(F=77.54,P<0.001)，HCC1937細胞培養(yǎng)48 h,細胞存活率呈劑量依賴性下降,但敏感性低于NC組及control mimics組，見圖1A、圖1C。

miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，結果顯示，與對照組比較，miR-21-5p在HCC1937細胞中表達為對照組的0.52倍(P<0.05)，Doc的ICD50(46.32±7.85)μmol/L明顯低于NC組(110.54±7.92)μmol/L及control inhibitor組(109.41±9.57)μmol/L(F=202.4,P<0.001)，HCC1937細胞培養(yǎng)48 h,細胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性下降,敏感性高于NC組及control inhibitor組，見圖1B、圖1D。

2.2 miR-21-5p調(diào)控PDCD4表達 通過靶基因預測軟件TargetScan、Genecard等預測，PDCD4與miR-21-5p可能存在靶向調(diào)控關系，見圖2A。qRT-PCR檢測顯示，在HCC1937/Doc細胞中PDCD4 mRNA表達明顯低于HCC1937細胞(t=6.254，P=0.003)，見圖2B。Western blot檢測顯示,在HCC1937/Doc細胞中，PDCD4蛋白表達明顯低于HCC1937細胞(t=5.942，P=0.004)，見圖2C；給予miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，qRT-PCR檢測顯示，PDCD4 mRNA表達明顯低于NC組HCC1937細胞(t=6.583，P=0.003)，見圖2D。Western blot檢測顯示,PDCD4蛋白表達明顯低于NC組HCC1937細胞(t=10.57，P=0.001)，見圖2E。給予miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，qRT-PCR檢測顯示，PDCD4 mRNA表達明顯高于NC組(t=4.242，P=0.013)，見圖2F。Western blot檢測顯示,PDCD4蛋白表達明顯高于NC組(t=4.611，P=0.009)，見圖2G。

3 討論

miRNA作為內(nèi)源性非編碼RNA，對細胞功能具有重要的調(diào)控作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡及增殖等具有相關性，并通過被上游基因調(diào)控或?qū)ο掠位蜻M行調(diào)控，影響腫瘤細胞的化療及放療耐藥[15-16]。多西他賽作為紫杉醇類化療藥，通過促進微管蛋白的聚合異常，抑制細胞有絲分裂過程中的紡錘體形成，從而影響微管的功能，破壞細胞有絲分裂，使腫瘤細胞停留在分裂期[17-18]。有研究顯示，miR-141、miR-125及miR-452等miRNA對乳腺癌細胞Doc耐藥均具有調(diào)控作用，其表達進行下調(diào)可以提高Doc耐藥乳腺癌細胞對Doc的敏感性[15-16]。miR-21在乳腺癌中表達上調(diào)，PDCD4在乳腺癌中表達下調(diào)。Rodrigues等[19]研究顯示，在肝細胞癌中，miR-21對PDCD4具有負向調(diào)節(jié)作用。

本研究顯示，給予miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，HCC1937細胞的Doc敏感性進一步降低，而給予miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，HCC1937細胞的Doc敏感性改善，并具有劑量依賴性。結果表明,上調(diào)miR-NA-21表達降低HCC1937細胞對Doc敏感度,下調(diào)miRNA-21改善HCC1937細胞對Doc的敏感性。miR-21-5p可能對乳腺癌細胞Doc敏感性具有直接或間接的調(diào)控作用。Hu等[20]對Doc耐藥的MCF-7乳腺癌細胞給予miR-452擬似劑或抑制劑，結果顯示，miR-452通過靶向調(diào)控APC4(Adenomatous polyposis coli,結腸腺瘤樣息肉)基因影響MCF-7的Doc敏感性。He等[2]認為，miR-944對乳腺癌細胞的化療耐藥也具有重要的調(diào)控功能。Zhao等[5]研究顯示，miR-638通過調(diào)控STARD10信號通路介導乳腺癌細胞的Doc耐藥。Zhou等[21]研究認為，miR-125b通過調(diào)控Bak1基因表達影響紫杉醇對乳腺癌細胞凋亡的促進作用，誘導乳腺癌細胞的紫杉醇耐藥。本研究進一步顯示，在HCC1937/Doc細胞中，PDCD4 mRNA及蛋白表達明顯低于對照組，給予miR-21-5p mimic轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，PDCD4 mRNA及蛋白表達明顯低于對照組，給予miR-21-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HCC1937/Doc細胞，PDCD4 mRNA及蛋白表達明顯高于對照組。結果表明，miR-21-5p對PDCD4具有負向調(diào)控作用，miR-21-5p作為促癌基因，負向調(diào)控抑癌基因PDCD4，從而介導HCC1937細胞對Doc的化療敏感性。Venturutti等[13]研究認為，對乳腺癌細胞中miR-21表達進行上調(diào)，可以誘發(fā)PDCD4表達水平降低，PDCD4是miR-21調(diào)控的下游靶基因。在多種惡性腫瘤中miR-21高表達，是促癌基因，PDCD4是miR-21的靶基因，可能作為惡性腫瘤治療的靶點[22]。Frankel等[14]研究也顯示，在乳腺癌細胞中PDCD4是miR-21重要的下游靶基因，miR-21通過對PDCD4基因表達進行調(diào)控，介導乳腺癌細胞的增殖、凋亡及浸潤等惡性行為。

圖1 miR-21-5p調(diào)控HCC1937細胞對Doc敏感性

圖2 miR-21-5p調(diào)控PDCD表達

靶向治療可能是提高晚期乳腺癌生存期的主要治療和研究方向[23]，本研究通過觀察miR-21-5p對乳腺癌HCC1937細胞Doc耐藥的影響，結果顯示，對miR-21-5p表達進行下調(diào)，可能通過上調(diào)PDCD4表達改善乳腺癌細胞的Doc敏感性，miR-21可能作為逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥的治療靶基因。