高 原， 郝悅君， 安曉麗， 孫浩丁， 廉美蘭， 金美玉

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)又名軟棗子、藤棗，是獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物[1]，主要分布于我國(guó)東北、華北以及長(zhǎng)江流域等地[2]。軟棗獼猴桃果實(shí)可直接食用，味道酸甜可口，其根可作為藥材，具有清熱利水、增強(qiáng)免疫力等藥用功效。軟棗獼猴桃根中的化合物大致可分為6種，分別是黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、五環(huán)三萜類(lèi)、甾體類(lèi)和生物堿類(lèi)等，其中黃酮類(lèi)化合物是軟棗獼猴的主要有效活性物質(zhì)之一，具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、調(diào)理肝臟等效果[3-5]。在抗癌、防癌以及抑制脂肪酶方面也有明顯功效[6]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn)[7]。目前，在軟棗獼猴桃根化學(xué)成分的提取分離和定量測(cè)定、抗腫瘤特性、抗炎特性等方面有許多研究報(bào)道[8]。但由于軟棗獼猴桃萌芽所需溫度低，發(fā)根時(shí)間長(zhǎng)[9]，扦插成活率低等問(wèn)題，導(dǎo)致軟棗獼猴桃根資源短缺，成為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化亟待解決的問(wèn)題之一[10]。因此，一些學(xué)者開(kāi)始尋找可以大量獲取植物資源的有效替代途徑。目前植物細(xì)胞或器官的培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)短期內(nèi)大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的目的，成為一種可替代植物資源傳統(tǒng)生產(chǎn)的有效途徑[11]。本研究利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)軟棗獼猴桃不定根，利用5種不同的溶劑對(duì)軟棗獼猴桃不定根進(jìn)行提取后，采用DPPH、ABTS和鐵離子螯合力等3種方法評(píng)價(jià)了不定根不同溶劑提取物的抗氧化活性，旨在為軟棗獼猴桃不定根應(yīng)用于抗氧化相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

軟棗獼猴桃組培苗由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。軟棗獼猴桃不定根見(jiàn)圖1。

圖1 軟棗獼猴桃不定根

將組培苗根切至1 cm長(zhǎng)接種于含25 mL培養(yǎng)基(MS+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L+8 g瓊脂，pH值5.8)的培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)不定根(圖1A)，將誘導(dǎo)出的不定根切至1 cm長(zhǎng)，精密稱(chēng)取30 g不定根接種于含4 L液體培養(yǎng)基的5 L氣球型生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)(圖1B)。培養(yǎng)基為MS+IBA 0.25 mg/L+蔗糖30 g/L，pH值5.8，通氣量調(diào)節(jié)為100 mL/min，在25 ℃的暗環(huán)境中培養(yǎng)30 d后，收獲不定根(圖1C)，在流水下沖洗3次，瀝干，置于45 ℃恒溫烘干箱中烘至恒重(48 h)，將其作為試驗(yàn)材料。

1.2 試劑和儀器設(shè)備

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，索萊寶公司，中國(guó))，2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，索萊寶公司，中國(guó))，過(guò)硫酸鉀(K2S2O8，麥克林公司，中國(guó))，抗壞血酸(VC，Sigma公司，美國(guó))，氯化亞鐵(FeCl2·2H2O，索萊寶公司，中國(guó))，其余試劑均為分析純。

YHW1103遠(yuǎn)紅外快速干燥箱(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；UV1102紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；JA2002電子天平(上海精天電子儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃不定根提取物的制備

稱(chēng)取干燥的不定根2 g，分別使用乙酸乙酯、正丁醇、水、甲醇和乙醇按照料液比1∶30進(jìn)行超聲提取，提取時(shí)間為1.5 h，收集濾液，重復(fù)3次后減壓濃縮至膏狀，置于45 ℃烘干箱中烘至恒重，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 軟棗獼猴桃不定根提取物總黃酮含量的測(cè)定

參照李偉等[12]方法測(cè)定總黃酮含量，并略作改動(dòng)。分別稱(chēng)取不同溶劑提取物0.01 g，用75%酒精溶解并定容至25 mL做樣品待測(cè)液。分別取濃度為0.04 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于試管中，取各樣品待測(cè)液0.4 mL 于試管中，用75%酒精定容至2 mL，加5%的NaNO2溶液0.3 mL，反應(yīng)6 min后，加10%的Al(NO)3溶液反應(yīng)6 min，再加4% NaOH溶液2 mL，在510 nm處測(cè)得吸光值。以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程：

y=4.183 2 x-0.001 1，R2=0.998 2

黃酮含量/(mg/g)=CVD×100

式中，C為樣品溶液濃度；V為樣品溶液體積；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 清除DPPH自由基活性測(cè)定

采用DPPH法[13]，將5種軟棗獼猴桃不定根提取物分別配置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的濃度，分別取2 mL上述樣品至試管中，加入2 mL濃度為0.1 mol/L的DPPH溶液，Vc做陽(yáng)性對(duì)照，避光反應(yīng)30 min，對(duì)照組用2 mL甲醇代替樣品，在517 nm處測(cè)定OD值。

清除率=(A對(duì)照-A樣品)/A樣品×100%

1.3.4 清除ABTS自由基活性測(cè)定

參照楚秉泉等[14]的方法，并略作改動(dòng)。用去離子水配置2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀和7 mmol/L的ABTS+·混合溶液。避光靜置16 h，使用前用去離子水稀釋至吸光值為 0.700±0.02(734 nm)的ABTS+·工作液。將5種軟棗獼猴桃不定根提取物分別配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的濃度，分別取0.1 mL待測(cè)樣本加入3.9 mL的ABTS+·工作液；空白組加入0.1 mL去離子水；空白對(duì)照組為加入0.1 mL甲醇?；靹蚝笫覝叵路磻?yīng)6 min，在734 nm下測(cè)定OD值。Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

ABTS+·清除率/%=[1-(A待測(cè)樣-A空白組)/A空白對(duì)照]×100%

1.3.5 鐵離子螯合能力測(cè)定

根據(jù)Fu等[15]的方法并稍作改進(jìn)，將5種軟棗獼猴桃不定根提取物分別配置成0.625、1.25、2.5、5、7.5、10 mg/mL的濃度，分別取50 μL待測(cè)樣品于96孔板中，加入137.5 μL蒸餾水，2.5 μL濃度為2 mmol的FeCl2溶液，搖勻后加入10 μL濃度為5 mmol的菲洛嗪溶液，室溫下靜置10 min。對(duì)照組以2.5 μL蒸餾水代替FeCl2溶液，空白組以50 μL蒸餾水代替樣品，于562 nm下測(cè)定OD值，同等濃度下檸檬酸做陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算鐵離子螯合能力。

螯合能力%=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100%

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)結(jié)果的平均值，利用Graphpad Prism 7軟件程序，采用T測(cè)驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。采用SPSS 22軟件程序，采用鄧肯氏新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物中總黃酮含量

分別對(duì)5種不同溶劑提取的軟棗獼猴桃不定根提取物中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，從圖2可以看出，不同溶劑間總黃酮含量有顯著性差異，黃酮含量依次為：乙酸乙酯>乙醇>正丁醇>甲醇>水，其中，乙酸乙酯提取物中總黃酮含量達(dá)到最高，為165.56 mg/g，其次是乙醇提取物，總黃酮含量為101.19 mg/g，甲醇和正丁醇提取物中總黃酮含量與乙醇提取物無(wú)顯著性差異，水提物黃酮含量?jī)H為62.27 mg/g。

圖2 不同溶劑提取軟棗獼猴桃不定根總黃酮含量

2.2 不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力

由圖3可知，軟棗獼猴桃不定根的5種提取物對(duì)DPPH自由基都有一定的清除能力，其中，乙酸乙酯提取物在濃度為0.1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了88.09%，而甲醇提取物在濃度為0.2 mg/mL時(shí)，清除率也達(dá)到了86.41%，清除能力稍低于VC(90.60%)。當(dāng)提取物濃度為0.1 mg/mL時(shí)，不同溶劑提取物清除DPPH自由基的能力依次為：乙酸乙酯>甲醇>乙醇>正丁醇>水。

圖3 軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力

2.3 不同溶劑提取物清除ABTS自由基能力

由圖4可知，不同溶劑提取物清除ABTS自由基的能力，在一定濃度范圍內(nèi)(0～1.0 mg/mL)存在著明顯的量效關(guān)系。乙酸乙酯提取物清除能力最強(qiáng)，在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了95.62%，稍低于陽(yáng)性對(duì)照VC(100%)。其次為甲醇提取物，水提取物的清除能力最弱。

圖4 軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物清除ABTS自由基能力

2.4 不同溶劑提取物對(duì)鐵離子的螯合能力

由圖5可知，不同溶劑提取物對(duì)鐵離子螯合能力的影響，隨著提取物濃度升高，螯合能力呈正相關(guān)，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，鐵離子螯合能力保持平穩(wěn)。其中，乙醇提取物螯合能力在7.5 mg/mL時(shí)達(dá)到了84.29%，其次是甲醇提取物螯合能力達(dá)到了69.38%，而乙酸乙酯提取物螯合能力也達(dá)到了61.79%，高出陽(yáng)性對(duì)照檸檬酸(58.90%)。

圖5 軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物鐵離子熬和能力

2.5 軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物抗氧化活性EC50

由表1可知，在3種方式下測(cè)定的軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物都具有一定的抗氧化活性，所有提取物在清除DPPH自由基和對(duì)鐵離子螯合能力上，都表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，在清除ABTS自由基試驗(yàn)中，乙酸乙酯提取物清除能力較為突出，其他提取物表現(xiàn)不明顯，而水提取物在清除自由基試驗(yàn)中效果均不理想，這可能與在乙酸乙酯提取物中檢測(cè)到最高含量的總黃酮有相關(guān)性。

表1 軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物抗氧化活性EC50

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)；-表示無(wú)活性；EC50超出測(cè)定濃度范圍的數(shù)據(jù)不進(jìn)行差異比較。

3 討論與結(jié)論

抗氧化與人體健康關(guān)系密切，當(dāng)人體的正?？寡趸瘷C(jī)制出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，如脂質(zhì)的過(guò)氧化、自由基的產(chǎn)生和抗氧化酶活力降低等，都會(huì)致使細(xì)胞損傷，容易引發(fā)癌癥、心臟病、機(jī)體衰老等[16]。體外抗氧化指標(biāo)主要可分為自由基的猝滅、還原力的衡量、金屬離子的螯合等[17]。而黃酮類(lèi)化合物作為一種天然的抗氧化劑，可以通過(guò)與鐵離子絡(luò)合，與超氧陰離子反應(yīng)等途徑，切斷羥基自由基的生成，制止自由基反應(yīng)引發(fā)，起到抗氧化作用[18]。黃春輝等[19]通過(guò)對(duì)幾種獼猴桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中總酚和類(lèi)黃酮含量以及抗氧化活性差異的研究，發(fā)現(xiàn)獼猴桃的果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)含量豐富，且隨著果實(shí)的不斷成熟，呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，抗氧化能力與總酚和類(lèi)黃酮含量呈顯著正相關(guān)。吳優(yōu)等[20]通過(guò)對(duì)軟棗獼猴桃揮發(fā)油GC-MS的分析及其抗氧化活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)軟棗獼猴桃揮發(fā)油在DPPH自由基清除和H2O2清除試驗(yàn)以及總還原能力測(cè)試中，均具有很好的抗氧化活性。張聲源等[21]采用DPPH法、ABTS法等方法對(duì)虎舌紅不同溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取物都表現(xiàn)出抗氧化活性，其中乙酸乙酯提取物的還原能力和清除自由基的能力均強(qiáng)于其他幾種溶劑。滕坤等[22]對(duì)軟棗獼猴桃栽培根的體外抗氧化活性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)栽培根提取物清除DPPH和ABTS自由基的EC50分別為27.01 mg/mL和29.55 mg/mL，而本研究中軟棗獼猴桃不定根乙酸乙酯提取物清除DPPH和ABTS自由基的EC50要顯著低于栽培根，這可能與用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的軟棗獼猴桃不定根含有更多的生物活性物質(zhì)含量，進(jìn)而提高了抗氧化活性。本試驗(yàn)中，5種溶劑提取的軟棗獼猴桃不定根提取物中均含有黃酮，其中乙酸乙酯提取物中總黃酮含量最高，為165.56 mg/g。幾種溶劑對(duì)于DPPH和ABTS自由基均具有清除能力，其中乙酸乙酯提取物清除能力最強(qiáng)，在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到了95.62%。隨著提取物濃度升高，鐵離子螯合能力呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，鐵離子螯合能力保持平穩(wěn)。在3種方式下測(cè)定的軟棗獼猴桃不定根不同溶劑提取物，都具有一定的抗氧化活性。本試驗(yàn)中，乙酸乙酯提取物在幾種測(cè)試中均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，這可能與在乙酸乙酯提取物中檢測(cè)到最高含量的總黃酮有相關(guān)性。因此，乙酸乙酯可以作為軟棗獼猴桃不定根抗氧化活性深入研究的極性溶劑，可用于今后軟棗獼猴桃不定根抗氧化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用。