岳圓圓， 陳 慧， 全英杰， 龔 晨， 李 鑫， 高 日*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.吉林廣播電視大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130000)

菊花(Chrysanthemummorifolium(Ramat.) Tzvel.)屬于菊科菊屬多年生宿根草本花卉。原產(chǎn)于我國(guó)，是我國(guó)傳統(tǒng)的名花，也是世界4大切花之一，深受各國(guó)人民的喜愛(ài)[1]。菊花品種繁多，花色豐富，姿態(tài)各異，鮮切小菊可以用來(lái)插制花籃、花束等，園林布景也可以用地被菊設(shè)計(jì)花壇和花臺(tái)等，具有很高的觀賞價(jià)值[2]。菊花大部分品種具有耐寒性，但也有部分品種耐寒性較弱[3]，生產(chǎn)中通常采用傳統(tǒng)雜交技術(shù)培育耐寒新品種，雜交后收獲得種子數(shù)量較少，土壤播種繁殖成活率較低，嚴(yán)重影響雜種后代的選育[4]。然而，采用組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)菊花成活率較高，而且繁殖系數(shù)大。李曉亮等[5]以地被菊花“香草水晶”莖尖為材料，研究瓶?jī)?nèi)快繁技術(shù)發(fā)現(xiàn)，試管苗增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L+白砂糖20 g/L，增殖系數(shù)為17.95；施敏等[6]以地被菊花“千代姬”的葉片為外植體，發(fā)現(xiàn)適合叢生芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，試管苗在培養(yǎng)基1/2 MS+0.1 mg/L NAA中生根較多，由此可見(jiàn)，菊花不同品種組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基成份有差異。本試驗(yàn)以“紅粉” × “延紅”雜交種子為材料，研究外植體消毒時(shí)間、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度以及基本培養(yǎng)基濃度對(duì)其增殖和生根的影響，旨在建立再生體系，為菊花的雜交品種選育和快繁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以抗寒品種“延紅”(父本)和蓮座花型“紅粉”(母本)進(jìn)行雜交，霜后收獲的種子為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

用洗衣粉清洗雜交種子后置于燒杯中，流水沖洗1～2 h，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用70%酒精表面消毒30～40 s后，生汞(HgCl2)溶液浸泡消毒。每個(gè)處理10個(gè)雜交種子，浸泡時(shí)間分別為5、8、11和14 min，無(wú)菌水沖洗后接種到MS+蔗糖30 g/L+瓊脂粉7.0 g/L(pH值5.8)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度1 600 lx，每天光照16 h。15 d后調(diào)查發(fā)芽率。

1.2.2 BA和NAA對(duì)試管苗增殖生長(zhǎng)的影響

將無(wú)菌苗切成1 cm長(zhǎng)的莖段，接種于MS附加

不同濃度BA和NAA的培養(yǎng)基中，BA濃度設(shè)為0.5，1.0，1.5和2.0 mg/L，NAA濃度設(shè)為0.1，0.2，0.3和0.4 mg/L，分別進(jìn)行組合，共16個(gè)組合，蔗糖30 g/L，瓊脂粉7.0 g/L，pH值5.8，每個(gè)處理重復(fù)3次。光照強(qiáng)度1 600 lx，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度70%，培養(yǎng)30 d后，調(diào)查株高，節(jié)數(shù)，地上部干物重和不定芽數(shù)。

1.2.3 IBA濃度對(duì)試管苗生根的影響

將1 cm左右長(zhǎng)的莖段接種在含有不同濃度IBA的MS培養(yǎng)基中，蔗糖30 g/L，瓊脂粉7.0 g/L，IBA濃度設(shè)為0.25，1.0，1.5，2.0 mg/L。每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)條件同1.2.1，30 d后，調(diào)查株高，地上部干重，根長(zhǎng)，根數(shù)和地下部干重。

1.2.4 MS培養(yǎng)基濃度對(duì)生根的影響

將試管苗分別接種于不同濃度的MS(1/4 MS，2/4 MS，3/4 MS和4/4 MS)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基其他成分為IBA 1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂7.0 mg/L，MS基本培養(yǎng)基設(shè)為培養(yǎng)條件同1.2.1，30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)株高，地上部干重，根長(zhǎng)，根數(shù)和地下部干重。

1.2.5 煉苗與移栽

清洗幼苗根系中的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)瓶中并加入水，覆蓋塑料薄膜保濕煉苗，7 d后，移栽到腐殖土和珍珠巖(3∶1)混合的基質(zhì)中，30 d后調(diào)查成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法作顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽的影響

試驗(yàn)利用升汞對(duì)種子進(jìn)行消毒，發(fā)現(xiàn)消毒時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率影響很大。由圖1可知，消毒時(shí)間從5 min增加至8 min時(shí)，種子發(fā)芽率逐漸增加，最高達(dá)到78.3%，但消毒時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，種子因種皮受到破壞，消毒液進(jìn)入種子內(nèi)使種子發(fā)芽率降低，在消毒14 min時(shí)，種子發(fā)芽率只達(dá)到7.5%。因此，為獲得無(wú)菌苗，“紅粉” × “延紅”雜交種子消毒時(shí)間以8 min為宜。

圖1 消毒時(shí)間對(duì)“紅粉” × “延紅”雜交種子發(fā)芽率的影響

2.2 BA和NAA濃度對(duì)試管苗增殖生長(zhǎng)的影響

將1 cm高的無(wú)菌苗接種在含BA和NAA不同濃度組合的培養(yǎng)基中，30 d后調(diào)查試管苗增殖生長(zhǎng)情況。BA和NAA不同濃度配比組間，節(jié)數(shù)有很大差異(表1)。

表1 BA和NAA濃度對(duì)試管苗增殖生長(zhǎng)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為0.05顯著水平的多重比較結(jié)果。

由表1可知，組合BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L的試管苗節(jié)數(shù)最多(7.7)，顯著高于其他組合，為對(duì)照的1.5倍。各組合中，試管苗不定芽數(shù)無(wú)顯著差異。對(duì)試管苗株高和干重進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，同樣在BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L組合中，試管苗生長(zhǎng)最佳，株高為5.9 cm，干重為506.7 mg，都顯著優(yōu)于對(duì)照(CK)和其他處理。因試管苗節(jié)數(shù)、株高及干重在BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L組合中最佳，可選擇此培養(yǎng)基作為“紅粉” × “延紅”雜交種試管苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

2.3 IBA濃度對(duì)試管苗生根的影響

在試管苗生根培養(yǎng)過(guò)程中，為了促進(jìn)試管苗根和莖葉的生長(zhǎng)，本試驗(yàn)在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的IBA進(jìn)行生根培養(yǎng)。結(jié)果表明，在所用培養(yǎng)基中試管苗均可生根。培養(yǎng)基中加入適宜濃度的IBA可促進(jìn)試管苗地上部和地下部的生長(zhǎng)，在IBA 1.0 mg/L時(shí)，根長(zhǎng)、根數(shù)、根干重、株高和莖葉干重均達(dá)到最高值，高于此濃度時(shí)，根及莖葉生長(zhǎng)反而低于對(duì)照。在IBA為1.0 mg/mL處理中，株高、莖葉干重、根長(zhǎng)、根數(shù)和根干重分別達(dá)到3.6 cm，394.8 mg，2.7 cm，13.8個(gè)和24.3 mg(表2)，尤其是根長(zhǎng)和根數(shù)，為對(duì)照的1.9和1.8倍。因此，在進(jìn)行試管苗生根培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中加入IBA1.0 mg/L較為適宜。

表2 IBA濃度對(duì)試管苗生根影響

2.4 MS基本培養(yǎng)基濃度對(duì)試管苗生根的影響

由表3可知，MS基本培養(yǎng)基濃度對(duì)試管苗根和莖葉的生長(zhǎng)影響很大。當(dāng)MS基本培養(yǎng)基濃度降至3/4時(shí)，利于試管苗根生長(zhǎng)，但MS濃度繼續(xù)下降時(shí)，試管苗生長(zhǎng)受到抑制。在3/4MS時(shí)，試管苗根長(zhǎng)、根數(shù)和根干重顯著高于MS培養(yǎng)基，但株高和莖葉干重與MS培養(yǎng)基無(wú)顯著性差異。因此，試管苗生根培養(yǎng)時(shí)可將MS培養(yǎng)基濃度降低至3/4。

表3 MS培養(yǎng)基濃度對(duì)試管苗根和莖葉生長(zhǎng)的影響

2.5 馴化移栽

增殖培養(yǎng)的試管苗(圖2a)經(jīng)生根后，選擇健壯的生根苗(圖2b)進(jìn)行馴化移栽。用清水沖洗試管苗根部的瓊脂后，將其放入裝有水的培養(yǎng)瓶中，用塑料薄膜覆蓋保濕，1周后，移栽到經(jīng)滅菌的栽培基質(zhì)中(腐殖土∶珍珠巖=3∶1)。移栽30 d后調(diào)查幼苗成活情況，其成活率高達(dá)95%以上(圖2c)。

圖2 “紅粉” × “延紅”雜交種的增殖(a)和生根試管苗(b)和移栽苗(c)

3 討論與結(jié)論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物形態(tài)發(fā)育具有重要作用，細(xì)胞分裂素和細(xì)胞生長(zhǎng)素合理的比例會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的分裂，誘導(dǎo)植株的增殖[7]。植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，常用的細(xì)胞分裂素為BA，ZT和KT等，生長(zhǎng)素為NAA和IBA等。目前，關(guān)于菊花組培方面的研究較多，但結(jié)果不盡相同，小黃菊不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L[8]，而菊花腦為MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L最利于“紅粉” × “延紅”雜交種試管苗增殖培養(yǎng)(表1)。這些研究表明，即便都是菊科植物，不同種或品種的組培所需培養(yǎng)基不同。因此，針對(duì)特定種或品種篩選適宜的培養(yǎng)基是提高培養(yǎng)效率的重要手段。另外，本研究發(fā)現(xiàn)BA和NAA對(duì)“紅粉” × “延紅”雜交種不定芽增殖無(wú)促進(jìn)作用，但可顯著增加株高和節(jié)數(shù)，因此，對(duì)于此雜交種進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)可以莖段作為主要的外植體。生根研究發(fā)現(xiàn)，3/4 MS培養(yǎng)基中，根生長(zhǎng)顯著好于MS培養(yǎng)基(表3)，但在2/4 MS或1/4 MS培養(yǎng)基中，試管苗地上和地下部生長(zhǎng)較弱，可能是培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度減少引起[10]。