郭書林，陳信忠，尤穎哲，陳何東，王藝紅，丁亦男，龔艷清，楊俊萍

（1.廈門海關(guān)，福建廈門 361016；2.漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建漳州 363000）

近年來新出現(xiàn)的對蝦傳染病常造成大批對蝦發(fā)病死亡，給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，其中最主要的疫病為急性肝胰腺壞死綜合征（acute hepatopancreas necrosis syndrome，AHPNS）[1]。該病主要發(fā)生于蝦苗放養(yǎng)后7～30 d，亦稱為早期死亡綜合征（early mortality syndrome，EMS）。該病從發(fā)生至今的10年間，給全球三大對蝦生產(chǎn)國——泰國、中國和越南的對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成30%～40%左右的減產(chǎn)[2]，給我國海南、廣東、福建、廣西等省份的養(yǎng)殖場造成了嚴重影響。為此，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入須通報水生動物疫病名錄。2013年5月，國際水產(chǎn)聯(lián)盟（GAA）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）先后宣布，導(dǎo)致AHPNS的病原體是副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）的特異變種。本研究利用泰國專家Flegel等[3]報道的PCR檢測方法，對福建省多家規(guī)模化南美白對蝦養(yǎng)殖場進行了AHPNS檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 采集福建省9家規(guī)模化南美白對蝦苗種繁育基地的患病對蝦幼體各10只，共獲得90份樣本。VP分離純化用培養(yǎng)基：青島海博公司產(chǎn)品；PCR mix反應(yīng)液：天根生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR引物：上海生工科技有限公司合成。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 PCR擴增儀：美國ABI公司生產(chǎn)；VITEK-2全自動細菌鑒定系統(tǒng)：法國生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取南美白對蝦幼體肝胰腺，按國家標準GB 4789.7—2013中的副溶血性弧菌分離純化鑒定方法，將得到的VP菌株作為PCR檢測用模板。

1.2.2 PCR檢測 PCR檢測通過引物AP3F：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'（SEQ ID NO:1） 和 AP3R：5'-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3'（SEQ ID NO:2）擴增質(zhì)粒pVA1的基因片段（以純化的VP作為模版），目的片段大小為336 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序、Blast比對后，確定分離所得的VP是否為攜帶質(zhì)粒pVA1的特異性VP菌株。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，AP3上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，抽提物 5 μL，加水補至 25 μL。按照以下程序進行擴增：94 ℃5 min，然后進行32次循環(huán)（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），72 ℃ 5 min，4 ℃ 保溫。

1.2.3 不同樣本處理方式對檢測結(jié)果的影響分析取肝胰腺，按DNA抽提試劑盒說明書提取DNA樣本，并以此作為PCR檢測模板；取肝胰腺，按1:10 的比例放入含1.5% NaCl的 TSB培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min，振蕩培養(yǎng) 5～6 h。蕩結(jié)束后，取菌液放入1.5 mL離心管中，3 000 r/min，離心5 min，棄上清，加PBS 懸浮，將增菌后的增菌液作為PCR檢測用DNA模板。將上述2種處理方式的檢測結(jié)果進行比較，分析不同樣本處理方式對檢測結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2.1 VP分離和PCR檢測

從9家規(guī)?；厦腊讓ξr養(yǎng)殖場分別取10只患病幼蝦，共獲得90份樣本，增菌后從其中33份樣本的弧菌顯色培養(yǎng)基平板上分離到疑似VP。挑取其中5個單菌落進行確認，發(fā)現(xiàn)氧化酶陽性，革蘭氏染色陰性，且VITEK-2全自動細菌鑒定系統(tǒng)確認為VP。鑒定確認的VP菌株分別來自于27份樣本，共81株（表1）。

對81株VP進行PCR檢測，檢出陽性菌株72株，PCR電泳結(jié)果見圖1。陽性菌株分別來自23份樣本，其中16份樣本的所有受檢VP菌株均為特異性菌株，6份樣本的部分受檢VP為特異性菌株，1份樣本的所有受檢VP均非特異性菌株，說明患病幼蝦肝胰腺存在不同基因型VP同時感染情況。

表1 VP分離和PCR檢測結(jié)果 單位：株/份

圖1 AP3引物擴增PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2 以肝胰腺DNA進行PCR檢測

90份樣本中，8份樣本的PCR檢測結(jié)果為陽性，包含于2.1結(jié)果中的22份PCR檢測特異性VP陽性樣本中，說明直接以肝胰腺DNA進行PCR檢測的方法靈敏性較低，較之于2.1方法的檢出率降低了約63%。

2.3 以肝胰腺增菌液進行PCR檢測

90份樣本中的25份樣本檢測結(jié)果為PCR陽性，其中22份樣本與2.1的檢測結(jié)果相吻合，而另3份樣本在2.1方法中的檢測結(jié)果為VP分離陽性而PCR陰性。兩種方法的檢測結(jié)果略有差距。

3 討論

2014年，有關(guān)AHPNS的病原學(xué)研究取得了重要進展，通過比較VP致病株與非致病株的基因序列，發(fā)現(xiàn)了與致病性相關(guān)的pVA1質(zhì)體，并證明致病性VP的毒素蛋白PirA和PirB是引起AHPNS的關(guān)鍵。Flegel等[3]公布了一種通過引物AP3檢測急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）VP分離株的新方法。該方法基于一種12 kDa蛋白質(zhì)的基因序列，AP3引物優(yōu)于之前公布的AP2引物，與先前推薦的100%敏感性、97.7%特異性、97.4%陽性預(yù)測值和100%陰性預(yù)測值相比，新方法具有100%的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。Flegel等認為，AP3擴增法對細菌分離株的DNA提取液具有足夠的敏感性，不建議將此方法應(yīng)用于嵌套的PCR。但是，對于來自蝦組織、小蝦或幼蝦糞便、整個幼體和其他疑似攜帶者以及來自池塘沉積物等環(huán)境源樣品，建議在含有1.5% NaCl補充物的TSB中進行初步富集，在30 ℃左右的溫度下振蕩培養(yǎng)4 h。此后，讓所有碎片沉淀，然后將混濁的上清液離心，收集細菌，丟棄上清液。從細菌顆粒中提取DNA，并使用大約100 ng的模板進行PCR測試。本試驗中，以從幼蝦肝胰腺中分離到的VP為DNA模板進行PCR檢測的靈敏性高，直接以幼蝦的肝胰腺為DNA模板進行PCR檢測的靈敏性較低，檢出率降低了63%。以肝胰腺增菌液進行PCR檢測，檢出3份陽性樣本，但經(jīng)VP分離后再進行PCR檢測的結(jié)果為陰性，推測可能PCR檢測試驗中未挑取到AHPNS陽性VP，造成了漏檢。另一種可能是以肝胰腺增菌液進行的檢測出現(xiàn)了假陽性；或者蝦體曾經(jīng)感染過AHPNS陽性VP，目前僅攜帶其DNA，而未攜帶VP活菌。因本試驗未進行回歸感染試驗，所以無法驗證以肝胰腺增菌液進行的PCR檢測與VP法的PCR檢測結(jié)果差異是否由假陽性導(dǎo)致。

將本試驗的VP PCR檢測結(jié)果與張娜等[4]的結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)該方法具有很好的檢出率和靈敏性，推測原因可能是對蝦樣本的選擇不同導(dǎo)致。本試驗中，對蝦樣本為患病幼蝦，而張娜的試驗對象是隨機采取的親蝦，而患病幼蝦肝胰腺中AHPNS陽性VP豐度可能較高，使得AHPNS陽性VP的檢出率顯著提高。

本試驗對福建省9家規(guī)?；瘜ξr養(yǎng)殖場的90份患病幼蝦樣本進行AHPNS檢測，從27份樣本中分離鑒定出81株VP，其中從22份樣本中分離到AHPNS陽性VP，顯示發(fā)病養(yǎng)殖場具有較高的VP感染風(fēng)險和AHPNS暴發(fā)風(fēng)險。