趙振山, 李海洋，趙振興，代 岱，郝孟輝

目前，肺癌已成為中國發(fā)病率最高的癌癥，病死率位居惡性腫瘤第一位[1]。肺癌大多發(fā)生于中老年人，但隨著煙草暴露、空氣污染、職業(yè)暴露、肺部疾病史、家族史等情況，逐年呈低齡化趨勢發(fā)展[2，3]。目前，肺癌5年生存率依舊較低，預后較差[4，5]，臨床缺乏較高靈敏度和特異度的早期篩查手段。腫瘤蛋白53(protein 53，p53)作為腫瘤抑癌基因之一，可調(diào)節(jié)一系列靶基因的活性，影響細胞生物學特性，參與眾多腫瘤發(fā)展進程[6- 8]。信號轉導子和轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)家族是一組介導細胞信號轉導的轉錄因子[9]。臨床已有研究，STAT3過度激活或表達介導多種惡性腫瘤，具有抑制其增殖和凋亡能力[10]。本研究旨在探討p53調(diào)控信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)信號通路在肺癌中的表達及其對肺癌增殖及凋亡的影響，從而驗證p53作為肺癌治療的候選靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺癌細胞系A549(購自美國模式菌種收集中心)；洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI)-1640培養(yǎng)液(invitrogen，gaitherburg，MD，USA)；CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；p53 siRNA(上海吉瑪公司，中國)；Opti-MEM、lipo2000試劑(Invitrogen公司，USA)；蛋白酶抑制劑混合物(Roche公司，瑞典)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)購自(Amersham pharmacia biotech公司)；鼠抗人p53、STAT3(購自艾博抗貿(mào)易有限公司)；細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒(Dojindo 研究所，日本)；自動酶聯(lián)免疫檢測儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；FACS Calibur流式細胞儀分析(BD公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞系培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、濕度95%的CO2培養(yǎng)箱。細胞傳代貼壁率應達90%。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗2次，0.25%胰酶消化，吹打成單細胞懸液。

1.2.2 細胞分組及轉染 細胞分組：空白對照組(不轉染任何序列)、陰性對照組[轉染無義小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)對照，用于做p53的對照]、p53 siRNA組(轉染p53 siRNA)、p53 siRNA+STAT3 siRNA組(同時轉染p53 siRNA和STAT3 siRNA)。吸取15 μl(50 μmol/L)siRNA，加入100 μl Opti-MEM中，加入lipo2000試劑進行稀釋并混勻，靜置5 min，siRNA與lipo2000混合，室溫20 min。加入800 μl無血清培養(yǎng)液，將混合物加到細胞中。細胞培養(yǎng)6 h，更換全新培養(yǎng)液，轉染48 h，收獲細胞。

1.2.3 Western Blot檢測p53、STAT3表達 取細胞，加蛋白裂解液，靜置冰上30 min。4 ℃，1200 r/min，離心10 min，取上清液分裝于離心管，-20 ℃保存。電泳80 V轉120 V，電泳至溴酚藍達凝膠底邊。濕轉轉移到PVDF膜。取PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉。加入一抗(鼠抗人p53，STAT3)，4 ℃過夜，Tris緩沖鹽水-Tween(TBST)緩沖液洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫旋轉孵育1 h，TBST洗3次；以β-actin為對照，進行化學發(fā)光，X線片壓片、顯影、定影，數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 細胞增殖試驗 新鮮完全培養(yǎng)液中重懸，接種于 96 孔板中，每組 5 個重復孔。使用 CCK-8 試劑盒，按說明書操作實驗流程。于轉染后 0、24、48、72 和 96 h 時，選擇波長為450 nm處測定各孔的吸光度(D)值。

1.2.5 流式細胞術AV-PI雙染法檢測A549細胞凋亡水平 利用siRNA對A549細胞中p53和STAT3進行敲減，于48 h獲待測細胞，制成單個細胞懸液，收集細胞沉淀，加入200 μl染液[1 ml 結合緩沖液 + 50 μl 膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin V)]；將樣品置于冰上染色30 min，后采用FACS Calibur流式細胞儀分析。

1.2.6 細胞劃痕試驗 待細胞融合度為 80%～90% 時，于培養(yǎng)板各孔底部使用 200 μl 微量移液器滴頭劃橫線傷口。隨后使用PBS 清洗1次，更換無血清培養(yǎng)液，使用倒置顯微鏡觀察不同時間(0、12、24、36 h )劃痕情況并拍照。

1.2.7 Transwell小室遷移實驗 備置單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度(1×105/ml)。上室滴入100 μl細胞懸液，下室加入500 μl含10%胎牛血清完全培養(yǎng)液， 37 ℃,5% CO2飽和濕度進行細胞培養(yǎng)。20～22 h后終止培養(yǎng)取出，洗滌上室未穿透膜細胞(×3)，甲醇固定15 min。蘇木精(HE)染色10 min，風干，中性樹膠封片。正置熒光顯微鏡觀察細胞穿膜數(shù)(5個高倍視野)。

2 結 果

2.1 Western blot檢測p53，STAT3蛋白的表達 p53蛋白表達在p53 siRNA組、p53 siRNA+STAT3 siRNA組明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.340)。p53siRNA組、p53siRNA+STAT3 siRNA組均明顯抑制了 STAT3的表達，與空白對照組和陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)?？瞻讓φ战M和陰性對照組STAT3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.364)。

圖1 p53和STAT3電泳條帶

2.2 p53靶向STAT3對A549生長的影響 CCK8檢測結果表明，與空白對照組和陰性對照組比較， p53 siRNA組，48、72、96 h細胞生長速度增長明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與p53 siRNA組相比，p53 siRNA+STAT3 siRNA組利用siRNA敲減STAT3后，48、72、96 h細胞生長速度顯著受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

時間空白對照組陰性對照組p53siRNA組p53 siRNA+STAT3 siRNA組0 h0.245±0.0080.240±0.0050.518±0.0070.231±0.00624 h0.288±0.0090.281±0.0100.576±0.0110.267±0.00948 h0.574±0.0090.568±0.0090.832±0.006①0.313±0.010②72 h0.858±0.0110.851±0.0101.415±0.014①0.583±0.012②96 h1.220±0.0121.215±0.0131.611±0.010①0.755±0.010②

注：與空白對照組和陰性對照組比較，①P<0.05；與p53 siRNA組比較，②P<0.05

2.3 p53表達水平改變后細胞各項能力的對比

2.3.1 流式細胞術AV-PI雙染法檢測p53對A549細胞的影響 流式細胞術AV-PI雙染法檢測結果表明，轉染p53的siRNA 48 h后， p53 siRNA組、p53 siRNA+STAT3 siRNA組A549細胞的凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

2.3.2 p53表達水平改變后細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示：與空白對照組和陰性對照組比較，p53 siRNA組和p53 siRNA+STAT3 siRNA組p53過表達后A549細胞的遷移速度均呈顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)；空白對照組和陰性對照組細胞遷移速度相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.770)。

2.3.3 p53表達水平改變后細胞侵襲能力的影響 Transwell實驗結果顯示：p53過表達后，空白對照組和陰性對照組比較，組間穿膜細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.517)，p53 siRNA組和p53 siRNA+STAT3 siRNA組A549細胞的穿膜細胞數(shù)較空白對照組和陰性對照組明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

組別凋亡率(%)遷移速度(μm/h)穿膜細胞數(shù)(n)空白對照組7.33±0.4330.10±6.2743.00±6.45陰性對照組7.65±0.43029.31±5.6341.15±6.06p53 siRNA組17.91±0.67①55.16±6.50①58.23±7.12①p53 siRNA+STAT3 siRNA組22.51±0.56①63.30±5.98①68.23±7.14①

注：與空白對照組和陰性對照組比較，①P<0.055

3 討 論

目前，國內(nèi)外對肺癌的治療研究逐漸向研發(fā)新的治療靶點與利用多種免疫靶向治療結合多種小分子靶向治療等模式發(fā)展[11]。已有研究人員從各個角度研究影響A549細胞的增殖、遷移、凋亡及侵襲的復雜機制[12]，并發(fā)現(xiàn)許多種基因與A549細胞有密切關系。其中p53就是一種真正的原癌基因，在刺激性環(huán)境下，p53表達的上調(diào)可促進腫瘤細胞的生長。

p53基因的表達一般受轉錄和轉錄后兩種水平調(diào)控，其表達一般較低，而經(jīng)刺激后水平顯著上升。異常p53表達導致細胞周期失控，促進某些癌基因激活，使細胞無限增長，進而導致腫瘤侵襲能力增加。同時，在多種腫瘤細胞中，STAT3在缺氧條件下活化，刺激多種促腫瘤血管生成因子的形成，例如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，從而促進腫瘤血管的生長，導致癌細胞的生長[13,14]。STAT3的活化能夠增強免疫逃逸，提示我們抑制STAT3活性(表達)可抑制免疫逃逸，增強機體抗腫瘤的免疫功能。下調(diào)STAT3的表達可顯著抑制腫瘤細胞的生長[15]。

本研究設計構建了STAT3 siRNA片段和p53 siRNA片段，通過流式細胞術AV-PI雙染法、細胞劃痕實驗、Transwell實驗結果顯示，p53 siRNA組和p53 siRNA+STAT3 siRNA組A549細胞各項能力與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義，說明肺癌中p53呈高表達，且與STAT3表達呈負相關， p53通過靶向STAT3，下調(diào)其表達，可促進A549細胞生長與侵襲，抑制其凋亡。推測STAT3可在某種機制下對腫瘤生長產(chǎn)生干預效應，可作用于肺癌的變化發(fā)展上。文獻[6]在研究中指出，STAT3能夠激活抗凋亡基因[如B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma，Bcl-2)]和細胞周期控制基因[如G1/S-特異性周期蛋白-D1(cyclinD1)]等基因的表達，進而影響腫瘤細胞周期變化，創(chuàng)造利于腫瘤生長的環(huán)境[16]。

國外研究證實，STAT3在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中可成為p53的直接靶點，p53功能的喪失可激活JAK2-STAT3信號傳導，從而促進腫瘤基質(zhì)的改變和腫瘤生長及對吉西他濱的抵抗[17]，可進一步推測p53通過靶向調(diào)控STAT3表達產(chǎn)生相關協(xié)同效應而導致肺癌細胞的增殖、遷移及凋亡。結果提示，通過探究p53靶向STAT3的機制及潛在作用，可有助于我們尋找減緩腫瘤生長、改變細胞浸潤的治療方案。

綜上所述，p53在肺癌中高表達，與STAT3蛋白表達呈負相關，從而促進A549細胞生長與侵襲，抑制其凋亡。因此，p53可能作為一種新的肺癌治療靶向分子，為惡性腫瘤的診斷及預后提供了一個新的渠道。但本研究只進行了體外細胞系的驗證，下一步需增加體內(nèi)實驗的驗證。另外p53是否還會通過其他途徑影響肺癌的增殖、遷移和凋亡，還需進行深入地研究。