井 峰，陳 兵

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種T細(xì)胞依賴、B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，其主要發(fā)病機(jī)制為突觸后膜乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)破壞，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭傳遞障礙，進(jìn)而引起骨骼肌無力。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)動(dòng)物模型因發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、電生理特點(diǎn)、免疫學(xué)特點(diǎn)等方面與人類MG相似，已成為研究MG重要的工具，被廣泛地用于MG發(fā)病機(jī)制的研究及治療方案的探索。構(gòu)建EAMG動(dòng)物模型有多種方法，近年來國內(nèi)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均使用大鼠源性AChR蛋白α亞單位97-116肽段(R97-116)為免疫原接種大鼠而建立EAMG動(dòng)物模型進(jìn)行研究[1, 2]。按照現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方案，使用R97-116為免疫原造模時(shí)需使用結(jié)核菌H37Ra作為耗材。H37Ra是人型結(jié)核分枝桿菌的減毒株，其具有H37Rv毒株的免疫原性，但無致病性[3]。H37Ra在我國尚無試劑公司進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，國外雖有商品化制劑，但由于試劑管控原因，難以從正規(guī)途徑獲得。是否可以在缺少H37Ra的情況下仍能以R97-116為免疫原成功建立EAMG模型尚未可知，查閱文獻(xiàn)目前無相關(guān)研究報(bào)道。在本研究中，我們將以R97-116為免疫原接種Lewis大鼠，探討H37Ra在該方案中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用雌性近交系SPF級Lewis大鼠，6～8周齡，平均體重(157.62±6.43)g，采購于北京維通利華有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共30只，分為實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白對照組，每組10只。3組動(dòng)物在完全相同的條件下飼養(yǎng)于我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。R97-116肽段序列為D GD F A I V K F T K V L L D Y T G H I，分子量為2252.57，產(chǎn)品純度>95%，委托金斯瑞生物技術(shù)公司合成。完全弗氏佐劑(complete Freund’s Adjuvant, CFA)和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s Adjuvant, IFA)均購于sigma公司。PBS緩沖液，購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。結(jié)核菌H37RA干粉購于BD(Difico)公司。大鼠AChR-Ab ELISA檢測試劑盒，購于北京瀚科恒譽(yù)生物科技有限公司。

1.2 方法 本實(shí)驗(yàn)參照Baggi等[4]的造模方法進(jìn)行操作。將R97-116溶于PBS溶液中，配制濃度為1 mg/ml。首次接種時(shí)，R97-116溶液、CFA、PBS按照1∶1.5∶1.5進(jìn)行配比，充分震蕩混勻制成乳劑。使用微量注射器在大鼠足墊、背部、腹部多點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，每只大鼠注射混合乳劑共200 μl。實(shí)驗(yàn)組所用乳劑每200 μl中加入H37RA干粉1 mg，對照組不添加H37Ra，空白對照組在皮下注射等量生理鹽水。首次接種后的30、45、60 d進(jìn)行強(qiáng)化接種。強(qiáng)化接種試劑按以下方案配比：R97-116、IFA、PBS比例1∶1.5∶1.5，混合震蕩為乳劑。使用微量注射器在大鼠足墊、背部、腹部多點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，每只大鼠注射混合乳劑200 μl。實(shí)驗(yàn)組所用乳劑每200 μl中加入H37RA干粉1 mg，對照組不添加H37Ra，空白對照組在相同時(shí)間于皮下注射等量生理鹽水。

1.3 臨床評估及抗體檢測 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每周稱重1次。對大鼠進(jìn)行分級前先使大鼠反復(fù)抓握籠頂30 s，以模擬疲勞試驗(yàn)的效果。動(dòng)物模型臨床癥狀評估采用Lennon等[5]制定的大鼠EAMG動(dòng)物模型臨床分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，未出現(xiàn)無力癥狀；1級，活動(dòng)輕度減少、撕咬無力、抓握力或叫聲減弱且易疲勞，尤其在重復(fù)抓握活動(dòng)后更明顯；2級，無力癥狀明顯，在抓握前就出現(xiàn)震顫、低頭、隆背、抓握力弱；3級，在抓握前即有嚴(yán)重的肌無力表現(xiàn)，無力抓握，處于瀕死狀態(tài)；4級，死亡。癥狀居中者評分分別為 0.5、1.5、2.5、3.5。麻醉大鼠后于尾靜脈取血，離心后取血清，使用ELISA法對所取血清的抗體進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)前5周各組大鼠均未出現(xiàn)明顯肌無力癥狀，Lennon分級均為0。第6周后實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)明顯肌無力表現(xiàn)，部分死亡；對照組僅有2只出現(xiàn)輕微癥狀，其余正常?？瞻讓φ战M大鼠無異常表現(xiàn)。至結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Lennon分級：4級3只，3～3.5級2只，2～2.5級2只，1～1.5級2只，0級1只。對照組1級2只，其余8只均0級?？瞻讓φ战M均0級。實(shí)驗(yàn)組中Lennon分級為1～3.5級的6只大鼠AChR抗體檢測均為陽性，0級的大鼠可疑陽性。對照組中Lennon分級為1級的2只大鼠中1只抗體可疑陽性，另1只陰性，Lennon分級為0級的8只大鼠抗體為陰性其余8只大鼠均為陰性?？瞻讓φ战M抗體檢測均為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠接種處皮膚出現(xiàn)脫毛、潰爛、結(jié)痂，足墊腫脹明顯并伴有炎性滲出物，提示局部炎性反應(yīng)(圖1A、B)，大鼠活動(dòng)明顯減少，撕咬、鳴叫力弱，靜止?fàn)顟B(tài)下呈隆背姿態(tài)(圖1C、D)，可發(fā)現(xiàn)明顯震顫，以上癥狀在持續(xù)抓握籠頂或活動(dòng)后更為明顯，肌無力癥狀明顯，同時(shí)體重降低。對照組大鼠僅在局部接種處出現(xiàn)炎性反應(yīng)，未觀察到明顯肌無力癥狀，僅2只大鼠出現(xiàn)輕微無力癥狀?？瞻讓φ战M未發(fā)現(xiàn)異常變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重[(190.21±8.35)g]，較對照組[(243. 22±7.98)g]和空白對照組[(251.22±5.81)g]低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組大鼠接種處及活動(dòng)狀態(tài)

A、B.實(shí)驗(yàn)組大鼠足墊、皮膚接種處出現(xiàn)腫脹、潰爛等局部炎性反應(yīng)；C.正常大鼠靜止?fàn)顟B(tài)下的姿態(tài)；D.實(shí)驗(yàn)組大鼠活動(dòng)減少，靜止?fàn)顟B(tài)下低頭、隆背

時(shí)間實(shí)驗(yàn)組對照組空白對照組0周156.13±3.24158.33±2.55157.61±4.422周169.77±4.12168.65±3.03169.97±3.244周181.37±3.22184.52±6.41186.71±5.126周199.45±6.41①210.35±7.85216.33±5.328周197.64±8.41①232.51±8.41238.32±4.2410周190.21±8.35①243.22±7.98251.22±5.81

注：與對照組、空白對照組比較，①P<0.05

3 討 論

據(jù)文獻(xiàn)[6]記載，首只EAMG動(dòng)物模型是Patrick在1973年使用從電鰻中提純AChR蛋白接種免疫家兔構(gòu)建而成。此后的研究發(fā)現(xiàn)大鼠、小鼠、豚鼠、猴均可用于EAMG模型的建立，其中又以大鼠最為常用。EAMG建模方案包括主動(dòng)和被動(dòng)免疫，主動(dòng)免疫建模的過程與人類MG的發(fā)病過程及病理機(jī)制更為接近且實(shí)驗(yàn)操作相對簡便，所以被多數(shù)實(shí)驗(yàn)所采用，使用提純的電鰻電器官AChR蛋白為免疫原最為經(jīng)典。然而電鰻在我國數(shù)量少且不易捕獲，且分離提純AChR蛋白的過程復(fù)雜，免疫原獲取困難限制了該方案的應(yīng)用。1990年Zhang等[7]的研究發(fā)現(xiàn)以人工合成的電鰻AChR蛋白α亞單位肽段為免疫原可誘導(dǎo)大鼠建立EAMG模型。隨后Baggi等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，與異種肽段相比，鼠源性肽段可更穩(wěn)定、有效地建立大鼠EAMG模型。研究發(fā)現(xiàn)以R97-116為免疫原建模成功率最高，該方案近年來已被多項(xiàng)研究所采用[8]。以往文獻(xiàn)報(bào)道使用該方法成模率>70%，本項(xiàng)研究中成模率相對較低可能與樣本量較小有關(guān)。

T淋巴細(xì)胞的抗原決定簇為小分子多肽片段，肽段序列的線性排列順序決定T細(xì)胞識(shí)別的特異性[9]，這是人工合成肽段用于建立免疫相關(guān)模型的理論基礎(chǔ)[10]。但R97-116肽段作為AChR蛋白所包含的眾多免疫決定簇之一僅可被大鼠T淋巴細(xì)胞所識(shí)別，因此所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答較弱。H37Ra具有完整的抗原性，可充分激活巨噬細(xì)胞，同時(shí)顯著上調(diào)IL-12、TNF-α的表達(dá)；巨噬細(xì)胞吞噬H37Ra后經(jīng)MHC分子途徑激活CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)而激活細(xì)胞免疫；而活化的CD4+T細(xì)胞所分泌的INF-γ則可進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞[11]。H37Ra可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和CD4+T相互作用而刺激和放大免疫反應(yīng)[12]。如前文所述R97-116肽段免疫原性較弱，接種大鼠后可能難以刺激機(jī)體產(chǎn)生明顯的特異性免疫應(yīng)答，這可能是對照組不能成功建模的原因。而實(shí)驗(yàn)組中使用H37Ra后有效地激活了大鼠的免疫系統(tǒng)，使其對免疫原性較弱的肽段產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而產(chǎn)生AChR抗體并建立EAMG模型。

筆者觀察到對照組中少量動(dòng)物出現(xiàn)較輕微的無力癥狀，AChR抗體可疑陽性。這可能與本研究所使用的CFA有關(guān)，該試劑中含有少量H37Ra，但由于含量少，不能充分激活大鼠免疫系統(tǒng)，因此對照組僅有少量大鼠對R97-116產(chǎn)生免疫應(yīng)答并出現(xiàn)輕微肌無力癥狀。僅使用R97-116和CFA并不能成功構(gòu)建穩(wěn)定、符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的EAMG動(dòng)物模型。

本研究提示H37Ra在以R97-116肽段為免疫原建立EAMG動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中有關(guān)鍵意義，在缺少H37Ra的情況下不能成功建模。H37Ra在該EAMG模型中的具體作用機(jī)制仍需從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等多角度進(jìn)一步研究。