周 平 劉 程 王秋石 朱志清 曹廣明 劉崇東 張震宇*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院手術室， 北京 100020；2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院婦產科， 北京 100020)

復發(fā)性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指孕22周前發(fā)生的同一性伴侶連續(xù)3次及3次以上的自然流產，在育齡婦女中發(fā)生率約1%～3%[1]，有RSA病史的婦女，早產率、胎兒子宮內發(fā)育遲緩和新生兒低出生體質量的風險均較一般人群高[2]。因此，RSA不僅危害婦女的身心健康，對其生育的下一代也有不良影響。引起 RSA的病因較多，隨著生殖免疫學研究的不斷發(fā)展，母胎界面局部免疫調節(jié)因素異常被認為是RSA的主要原因[3]。間充質干細胞具有強大的免疫調節(jié)能力，胎盤提取的間充質干細胞數量眾多，質量穩(wěn)定，已被應用于系統性紅斑狼瘡等嚴重免疫性疾病的患者，有效地控制了疾病的進展[4-6]。因此，本研究利用經典高危的流產小鼠模型(CBA/J雌性×DBA/2J雄性)，通過計算胚胎吸收率、胎鼠質量及胎盤質量等觀察人胎盤間充質干細胞(placenta-derived mesenchymal stem cells, PMSC)治療RSA小鼠的效果，從而為RSA患者的治療提供新的治療方法及治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1)實驗動物：CBA/J雌性×DBA/2J雄性小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0004。6～8周齡清潔級雌性CBA/J小鼠12只，雄性DBA/2J小鼠6只。

2)人胎盤間充質干細胞：購自博雅干細胞公司，為原代培養(yǎng)的第5代細胞，經流式細胞儀檢測，CD73、CD90和CD105表達陽性，CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR表達陰性，符合間充質干細胞特性。

3)實驗試劑：兔抗鼠單克隆CK8抗體、兔抗鼠多克隆Laminin 抗體購自美國Abcam公司。免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 CBA/J雌性×DBA/2J雄性小鼠模型和人胎盤間充質干細胞移植方法

雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J小鼠按2∶1比例合籠交配，建立妊娠小鼠模型，小鼠于晚上6點合籠，次日上午8點檢查陰栓，檢出陰栓者記為妊娠第0.5天；未檢出者繼續(xù)交配，如2 d后未檢出陰栓，將雌性小鼠和雄性小鼠分開飼養(yǎng)3 d后再次合籠，如此反復，直至檢出陰栓為止。將檢出陰栓的小鼠12 只分為對照組和實驗組。對照組于孕第1天經尾靜脈注射PBS 0.2 mL；實驗組于孕第1天經尾靜脈注射0.2 mL PBS重懸的1×106個人胎盤間充質干細胞。

1.3 胚胎吸收率計算方法

見栓后13 d處死小鼠，具體方法：麻醉兩組小鼠，暴露雙側子宮，觀察各組胚胎著床情況，計數胚胎吸收率。胚胎吸收的判定標準：胚胎體積與對照組相比減小，子宮呈“竹節(jié)”狀，或胚胎完全吸收至未孕狀態(tài)，胚胎-胎盤單位有明顯淤血、組織變性或壞死，上述現象出現其一即判定為胚胎吸收。胚胎吸收率=胚胎吸收數/(胚胎吸收數+胚胎存活數)×100%。

1.4 比較兩組胎盤滋養(yǎng)細胞侵潤情況

取兩組各3只小鼠娩出胎盤組織，每只小鼠留取3個胎盤， 置10%(體積分數)中性甲醛溶液固定24 h以上。常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為6 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化， PBS液沖洗。采用SP法(二步法)免疫組織化學染色。兔抗鼠單克隆CK8抗體的工作濃度為1∶200、兔抗鼠多克隆Laminin 抗體的工作濃度為1∶250， 操作步驟均按試劑盒說明書要求進行。

分析了來自5只孕鼠的5個胎盤，每個胎盤隨機取5個視野進行拍照，借助Image Plus 軟件計算和統計分析胎兒血管(fetal blood vessel，FBV)面積和母體血竇(maternal blood sinus，MBS)面積， 同時對浸潤到蛻膜組織的CK8陽性滋養(yǎng)細胞的數量進行計數，并測量蛻膜層中CK8陽性滋養(yǎng)細胞與海綿層基線的距離。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組胚胎吸收率比較

實驗組共有6只雌鼠妊娠，胚胎存活60個、胚胎吸收5個、胚胎吸收率為8.3%，對照組共有6只雌鼠妊娠，胚胎存活60個、胚胎吸收17個、胚胎吸收率為28.3%，實驗組的胚胎吸收率明顯高于對照組，差異有統計學意義(χ2=8.01，P=0.005)。各組妊娠子宮形態(tài)及胎鼠和胎盤對比見圖1。

A：morphology of uterine of pregnant mice of control group;B：morphology of fetus and placenta of control group;C:morphology of uterine of pregnant mice of experimental group；D:morphology of fetus and placenta of control group of experimental group.

2.2 各組胎鼠及胎盤重量比較

實驗組胎鼠質量為(1 185.57±87.92)g，胎盤質量為(674.36±66.29)g。對照組的胎鼠質量為(981.57± 118.25)g，胎盤質量為(572.25±89.25)g。實驗組的胎鼠及胎盤質量均高于對照組，差異有統計學意義 (P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組胎鼠和胎盤質量比較Tab.1 Comparison of the quality of fetal and placenta

2.3 兩組小鼠胎盤迷路層的結構分析

以層黏連蛋白Laminin標記胎兒血管，可見與實驗組相比，對照組胎盤中胎兒血管分支明顯減少，胎兒血管總面積以及母體血竇總面積均顯著降低(圖2)。

2.4 滋養(yǎng)層細胞侵潤能力的變化比較

用滋養(yǎng)細胞標記分子CK8對胎盤切片進行免疫組織化學染色，對侵潤到蛻膜組織的CK8陽性滋養(yǎng)細胞的數量進行計數，實驗組明顯高于對照組；測量蛻膜層中CK8陽性滋養(yǎng)細胞與海綿層基線的距離，實驗組滋養(yǎng)細胞向蛻膜遷移的距離顯著遠于對照組(圖3)。

圖2 兩組胎兒血管總面積以及母體血竇面積比較Fig.2 Comparison of total area of fetal blood vessel and maternal sinus area

A: Immunohistochemistry results show the distribution of Laminin in placenta of control group;B: Immunohistochemistry results show the distribution of Laminin in placenta of experimental group;C: Fetal blood vessels (red) area and the maternal blood sinus (blue) area were calculated by Image J plus software of control group ;D: Fetal blood vessels (red) area and the maternal blood sinus (blue) area were calculated by Image J plus software of experimental group.E: analysis of lbayrinth layer，**P<0.01.

3 討論

引起 RSA的病因較多，目前認為RSA的病因包括遺傳因素，感染因素、解剖學異常、內分泌因素、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)等，其中近50%的RSA與免疫相關[7]，母胎界面局部免疫調節(jié)因素異常被認為是RSA的主要原因[8]。

母體對半同種異體胚胎的免疫耐受是成功妊娠的關鍵因素，多種免疫細胞，如NK細胞、T細胞、巨噬細胞等以及多種免疫調節(jié)因子均參與了母胎界面的局部免疫調節(jié)，而任一免疫細胞或免疫調節(jié)因子的失衡，均會導致母胎界面的免疫不耐受，而致流產。針對同種免疫型RSA，既往多種免疫治療方法，如集落刺激因子(granular colony stimulating factor，C-CSF)和丙種球蛋白等均經歷了臨床實踐研究階段，只在部分患者中取得治療效果，且經系統評價分析大量數據后發(fā)現這些免疫治療方法并沒有降低RSA患者的流產率及提高活產率[9-10]。說明免疫功能異常相關的RSA患者，單一、定向的方法調節(jié)某一種細胞或細胞因子，可能不能達到預期的效果。說明RSA的免疫治療可能需要更深層次或者更全面的免疫功能調節(jié)方法。

圖3 兩組CK8表達陽性的滋養(yǎng)細胞侵潤情況比較Fig.3 Comparison of invasion of CK8(+) cells between two groups

A: Immunohistochemistry for Cytokeratin 8 in the placenta of control group;B: Immunohistochemistry for Cytokeratin 8 in the placenta of experimental group;C: Number of Cytokeratin 8-positive cells in the deciudal tissues and distance of cytokeratin positive cells from the base line of spongiotrophoblast region of control group;D: Number of Cytokeratin 8-positive cells in the deciudal tissues and distance of cytokeratin positive cells from the base line of spongiotrophoblast region of experimental group;E: Comparison of invasion of CK8(+) cells，**P<0.01

干細胞作為重要的免疫調節(jié)細胞，已被證實可以有效調節(jié)免疫功能，在治療自身免疫系統疾病，如系統性紅斑狼瘡、硬皮病等，以及抑制移植物抗排異反應方面具有突出效果[4-6]。間充質干細胞是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，屬于非終末分化細胞，它既有間質細胞，又有內皮細胞及上皮細胞的特征。間充質干細胞在體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經、肝、心肌、胰島β細胞和內皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。目前的臨床應用方向，主要包括器官或組織的修復以及免疫系統功能的調節(jié)兩方面。作為免疫調節(jié)主要應用于促使造血干細胞移植物的植入以及治療移植物抗宿主??；另外，應用于自身免疫病，如系統性紅斑狼瘡、硬皮病、類風濕關節(jié)炎等，取得了良好的臨床治療效果。

本研究采用CBA/J雌鼠與DBA/2J雄鼠交配制作RSA小鼠模型，已有研究[11-12]經證實該模型雌性小鼠妊娠后，在胚胎著床早期，母體血液系統和母胎界面局部均存在免疫功能異常，包括NK細胞和T細胞異常激活，共刺激因子增加，補體沉積增加，以及和炎性反應相關的淋巴細胞活動增加等[11-12]。因此本研究擬利用該模型，在見栓后對雌性小鼠進行尾靜脈注射PMSC，通過PMSC的免疫調節(jié)作用，調節(jié)雌性小鼠的全身及局部的免疫功能，通過計算各組小鼠的胚胎吸收率以及比較各組胎鼠及胎盤的質量，結果顯示PMSC可以增強母鼠的免疫耐受能力，降低免疫系統對胚胎的排斥反應，增加了滋養(yǎng)細胞向子宮蛻膜的侵潤能力，顯著提高胚胎的著床能力，從而降低胚胎的吸收率。

綜上所述，PMSC能夠降低RSA小鼠的胚胎吸收率，增加胎鼠及胎盤質量，改善妊娠結局，為實現自然流產的早期預防和治療提供了新的方向。