薛興奎 韓新華 蔡思齊 陳曉玲 Melody Y. Zeng

(1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518109；2.深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東深圳 518109；3.南方醫(yī)科大學(xué)研究生院檢驗(yàn)技術(shù)系，廣州 501505)

CD26/DPPIV是多功能蛋白分子，在T細(xì)胞、上皮細(xì)胞等組織細(xì)胞上均有表達(dá)，在體內(nèi)有兩種存在形式：細(xì)胞表面分子和可溶性分子?？扇苄苑肿訌V泛存在于血清/血漿、關(guān)節(jié)液等體液中[1]。CD26/DPPIV具有絲氨酸蛋白酶活性，能夠特異性切割N-末端的脯氨酸或丙氨酸，不但對(duì)于增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)刺激信號(hào)的反應(yīng)起著重要作用，而且在關(guān)節(jié)炎等疾病中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。CD26分子作為T(mén)細(xì)胞的協(xié)同刺激因子，參與多種免疫學(xué)效應(yīng)。西他列汀(Sitagliptin)是一種高效CD26/DPPIV抑制劑，能夠特異性抑制DPPIV蛋白酶活性。利用西他列汀長(zhǎng)久而穩(wěn)定的抑制DPPIV酶活性，對(duì)于研究CD26/DPPIV分子功能，探索其在多種疾病中的發(fā)病機(jī)制，具有重要的意義。研究[2]顯示，小鼠和人體體內(nèi)DPPIV活性難以得到穩(wěn)定而持續(xù)的抑制，常規(guī)給藥方法導(dǎo)致CD26/DPPIV酶活性呈波動(dòng)狀態(tài)，影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與重復(fù)性。微滲透泵是一種較為理想的持續(xù)給藥系統(tǒng)，本課題組擬采用滲透泵體內(nèi)植入給藥，研究小鼠體內(nèi)西他列汀給藥效果，探索穩(wěn)定持久的DPPIV酶活性抑制方式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料

SPF級(jí) BL6/C57 雄性小鼠，8～12周齡，體質(zhì)量18～22g，由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2015-0063。西他列汀購(gòu)于美國(guó)Selleck Chemical公司。微滲透泵(Model:2001)由美國(guó)Alzet公司生產(chǎn)。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為西他列汀皮下注射200、100、50 mg/kg組和滲透泵植入(內(nèi)含200 mg/kg西他列汀)組，滲透泵植入[內(nèi)含0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液]組，每組小鼠數(shù)量為6只，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次，各組小鼠分別于給藥后1、2、4、8、16、24 h采血。

1.2 滲透泵植入

按照微量滲透泵說(shuō)明書(shū)和參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行手術(shù)植入滲透泵，在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)腹腔麻醉小鼠后，在小鼠后頸部作一個(gè)長(zhǎng)約1．5 cm橫切口，植入灌注西他列汀(200 mg/kg劑量西他列汀)或0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(對(duì)照組)的Alzet微滲透泵并無(wú)菌縫合，滲透泵保留皮下24 h。

1.3 血漿藥物濃度與DPPIV蛋白酶活性監(jiān)測(cè)

按照給藥后不同時(shí)間點(diǎn)，從小鼠尾靜脈取血，室溫離心后取血漿。西他列汀血藥濃度采用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)檢測(cè)，氟西汀作為內(nèi)標(biāo)參照。DPPIV 蛋白酶活性監(jiān)測(cè)采用美國(guó)ENZO Life Science公司試劑盒方法，用二甲基亞砜(DMSO)及DPPIV 緩沖液溶解底物GlyPro-pNA，取緩沖液、血清樣本及底物置于96孔平底培養(yǎng)板中，在37 ℃中反應(yīng)30 min，在多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)上分別讀出A405值。取500 mmol/L的純pNA倍比稀釋后讀出相應(yīng)的A405值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算DPPIV蛋白酶活性相對(duì)于對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾T細(xì)胞CD26分子

將給藥后24 h的小鼠處死后，采用無(wú)菌操作法取脾臟，并制成細(xì)胞懸液，采用抗體磁珠法純化T細(xì)胞(德國(guó)Miltenyi公司)。用FACS緩沖液洗滌，洗滌后分成每管細(xì)胞為1×106個(gè)，分別加入同型對(duì)照、PE-CD26(美國(guó)BD公司)各10 μL抗體，室溫避光15 min，緩沖液洗滌2次，采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)上機(jī)分析，數(shù)據(jù)應(yīng)用Flow Jo軟件分析。

1.5 小鼠T細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

T細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)的24孔板檢測(cè)，經(jīng)注射不同濃度西他列汀的小鼠脾T細(xì)胞置于膜上的小室，膜下的小室加入含有基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1α(storma cell derived factor 1α,SDF-1α)的無(wú)血清培養(yǎng)基AIM-V，在37 ℃孵箱孵育4 h后，計(jì)數(shù)穿越薄膜的細(xì)胞。結(jié)果采用相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的百分比表示。

1.6 病理切片觀察小鼠皮膚

將處死小鼠皮膚組織滲透泵周邊皮膚約0.5 cm取下，固定于10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛內(nèi)，縱向和橫向切取，按常規(guī)制備石蠟切片，切片厚度為5 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，用 Olympus顯微鏡觀察并照相。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 西他列汀血藥濃度

為研究不同給藥方法對(duì)血藥濃度的影響，分別給予小鼠西他列汀不同劑量直接皮下注射或皮下微泵組植入小鼠皮下，微泵組西他列汀血藥濃度變化趨勢(shì)與皮下注射組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物劑量比皮下注射穩(wěn)定。直接皮下注射西他列汀在6～8 h血藥濃度明顯下降，在給藥后24 h無(wú)法檢測(cè)到，而通過(guò)滲透泵給藥組血藥濃度可維持至24 h(圖1)。

2.2 西他列汀抑制小鼠體內(nèi)DPPIV蛋白酶活性

通過(guò)DPPIV活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)給藥8 h后，在皮下注射用藥組中，小鼠血清中的DPPIV酶活性與基線比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)皮下滲透泵給藥組(200 mg/kg)中，小鼠血漿中DPPIV酶活性明顯降低且能持續(xù)24 h，與0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖1 血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.1 Plasm concentration-time curve in the mice

圖2 西他列汀抑制血漿CD26/DPPIV活性Fig.2 CD26/DPPIV enzyme inhibited by Sitagliptin

2.3 西他列汀對(duì)小鼠脾T細(xì)胞CD26/DPPIV分子表達(dá)和T細(xì)胞遷移的影響

收集注射西他列汀24 h后的小鼠脾T細(xì)胞，采用流式細(xì)胞檢測(cè)CD26/DPPIV分子的表達(dá)，與對(duì)照組相比，CD26分子的表達(dá)無(wú)明顯變化，西他列汀不影響細(xì)胞表面CD26/DPPIV分子的表達(dá)(圖3A)。為了研究CD26分子在T細(xì)胞遷移中的作用，收集注射西他列汀24 h后的小鼠脾細(xì)胞，采用抗體磁珠法純化后，檢測(cè)T細(xì)胞的趨化遷移能力。經(jīng)滲透泵給藥處理的T細(xì)胞遷移數(shù)量與對(duì)照組相比，減少了36.01%(P<0.05，圖3B)。

2.4 小鼠耐受性良好

滲透泵經(jīng)手術(shù)植入到小鼠皮下，長(zhǎng)約1.5 cm，對(duì)小鼠是一種額外的負(fù)擔(dān)。在本實(shí)驗(yàn)中，植入滲透泵小鼠的活動(dòng)度與飲食無(wú)明顯異常。在小鼠骨髓移植等器官移植模型中，皮膚損害是常見(jiàn)的移植物抗宿主病表現(xiàn)，如果微泵對(duì)皮膚造成損傷將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為觀察西他列汀通過(guò)滲透泵給藥能否引起皮膚損傷，處死植入滲透泵24 h的小鼠后取泵旁皮膚制作病理切片，行HE染色，觀察小鼠皮膚病理變化。西他列汀藥物組小鼠與0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液小鼠相比，大致正常，無(wú)明顯炎性反應(yīng)(圖4)。

3 討論

CD26/DPPIV分子是參與T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的一種具有絲氨酸蛋白酶活性的糖蛋白分子，在T細(xì)胞活化后表達(dá)增高，同時(shí)參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制。CD26相對(duì)分子質(zhì)量為110 000，能夠特異性切割N-末端的脯氨酸或丙氨酸[4]，廣泛存在于血清/血漿、腦脊液、關(guān)節(jié)液中；跨膜蛋白分子在眾多組織中都有表達(dá)，如骨髓、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺、脾、胰、肝、腸道和多種上皮細(xì)胞[5]。數(shù)種關(guān)鍵細(xì)胞因子和趨化因子都是CD26分子蛋白酶的底物，包括RANTES、CCL11、巨噬細(xì)胞來(lái)源的趨化因子(CCL22)、CXCL10等[6]。西他列汀是CD26分子的特異性抑制劑，能夠抑制CD26分子的蛋白酶活性。鑒于DPPIV在血漿等各種體液中存在，起著多種不同的作用，因此成為免疫、器官移植、內(nèi)分泌等多學(xué)科研究人員的研究靶點(diǎn)[7]。特異性抑制劑西他列汀成為研究CD26/DPPIV分子功能與體內(nèi)作用的重要工具。在前期體外研究中發(fā)現(xiàn)，西他列汀能夠在較低劑量情況下抑制血漿中DPPIV酶活性。而在小鼠體內(nèi)，DPPIV分子酶活性由于受復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境影響，很難得到穩(wěn)定而完全的抑制。Farag等[8]在藥代動(dòng)力學(xué)臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，人體西他列汀血藥濃度與血漿中DPPIV濃度相關(guān)，DPPIV酶活性在2 h左右達(dá)到最大抑制，隨后6～10 h內(nèi)恢復(fù)至接近正常。Waget等[9]報(bào)道，每只400 μg西他列汀不能明顯的抑制小鼠體內(nèi)血漿DPPIV活性。這些研究[8-10]結(jié)果提示，穩(wěn)定而持久的血漿濃度是西他列汀有效抑制DPPIV酶活性的前提條件。

圖3 小鼠脾T細(xì)胞CD26表達(dá)與遷移Fig.3 CD26 expression and migration on spleen T cells

A:CD26 expression;B:migrated T cells.*P<0.05vssaline control group; The spleen T cells were harvested 24 hours post treatment and were assayed for migration.

圖4 小鼠皮膚的病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)Fig.4 Pathological morphology of mice skin

為了獲得理想穩(wěn)定的血藥濃度，本研究選用了ALZET皮下滲透泵，結(jié)果顯示與一次性皮下注射相比，接受滲透泵藥物治療組血藥濃度相對(duì)穩(wěn)定，在給藥后24 h仍有較高的血藥濃度，而無(wú)滲透泵組在給藥后24 h無(wú)法檢測(cè)到西他列汀。同時(shí)，滲透泵組小鼠血漿CD26/DPPIV酶活性被穩(wěn)定持久的抑制，而一次注射組DPPIV活性在給藥后第2小時(shí)降低，但在給藥后第8小時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)接近正常值。這些結(jié)果說(shuō)明，DPPIV活性可以通過(guò)滲透泵給藥得到穩(wěn)定而持久的抑制，同時(shí)避免了每天多次注射的繁瑣。但是并非所有的小分子化合物都適合使用滲透泵，結(jié)果會(huì)根據(jù)藥物的體內(nèi)分布模式、代謝途徑的不同而具有明顯差異[10]。

CD26分子及其具有的蛋白酶活性是調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化與執(zhí)行免疫功能的重要分子，對(duì)于增強(qiáng)細(xì)胞刺激信號(hào)的反應(yīng)起著重要作用，在關(guān)節(jié)炎、心力衰竭、Crohns腸病等疾病中起著重要的調(diào)控作用。DPPIV分子酶活性與小鼠免疫功能密切相關(guān)，通過(guò)多種途徑參與免疫細(xì)胞激活、活化、增生等。采用滲透泵給予西他列汀藥物小鼠組的脾T細(xì)胞遷移能力受到明顯的抑制，而一次性給藥組無(wú)明顯變化，提示通過(guò)滲透泵給藥是體內(nèi)研究DPPIV對(duì)免疫功能影響可以更好地模擬穩(wěn)態(tài)環(huán)境。與不同濃度的一次性給藥組相比，滲透泵給藥組的小鼠脾T細(xì)胞CD26分子表達(dá)無(wú)明顯變化。這些提示西他列汀是通過(guò)抑制DPPIV蛋白酶活性而不是影響T細(xì)胞CD26分子表達(dá)而影響T細(xì)胞遷移。

滲透泵需要皮下植入，對(duì)于小鼠是一種額外的負(fù)荷，通過(guò)對(duì)小鼠活動(dòng)度、飲食的監(jiān)測(cè)與觀察，滲透泵給予西他列汀沒(méi)有明顯降低小鼠的活躍度。在骨髓、肝腎等器官移植小鼠模型中，滲透泵需要長(zhǎng)期植入[11-12]。由于滲透泵是皮下植入，本研究提取了植入滲透泵附近的小鼠皮膚進(jìn)行病理切片檢查，發(fā)現(xiàn)皮膚無(wú)明顯異常，提示通過(guò)滲透泵給予西他列汀對(duì)皮膚無(wú)明顯刺激和損害，可以用于小鼠移植物抗宿主病等研究模型。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，為了獲得穩(wěn)定的DPPIV酶活性抑制，研究了皮下滲透泵作為西他列汀的給藥方式，發(fā)現(xiàn)通過(guò)滲透泵給藥可以提高血藥濃度，持續(xù)抑制小鼠體內(nèi)DPPIV活性，并且有效的長(zhǎng)時(shí)間抑制T細(xì)胞遷移，對(duì)小鼠體質(zhì)量和皮膚無(wú)明顯影響。這些結(jié)果顯示，采用滲透泵給予西他列汀，可在動(dòng)物體內(nèi)更好的控制酶活性，對(duì)于研究CD26分子的功能與相關(guān)效果體內(nèi)研究提供了有效的給藥途徑。