王兆佳 武 燁 劉 丹 王美麗 隗 歆 劉慧榮*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069；2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300)

《中國(guó)心血管病報(bào)告 2017》[1]顯示，心血管疾病是威脅我國(guó)公眾健康的主要的危險(xiǎn)因素，呈逐年增高、居高不下的趨勢(shì)，因此研究心血管疾病、尤其是各種心血管疾病的終末階段——心力衰竭就顯得尤為重要。多種機(jī)制參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，包括：交感神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、心血管活性物質(zhì)分泌失衡、 細(xì)胞損傷等[2]。其中交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)興奮被證實(shí)為促進(jìn)心力衰竭發(fā)生的核心機(jī)制之一[3]，其主要機(jī)制為心肌細(xì)胞β1腎上腺素能受體(β1-adrenergic receptor，β1-AR)持續(xù)激活[4]。據(jù)調(diào)查[5]，40%～60%的心功能不全患者血清中可檢測(cè)到β1腎上腺素受體自身抗體(β1-adrenergic receptor autoantibody，β1-AA)，其與β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)特異性結(jié)合，起到類激動(dòng)劑樣作用，且具有持續(xù)激活不脫敏的特點(diǎn)，最終損傷心肌[6]。工作的心肌高度依賴線粒體呼吸維持足夠的能量供應(yīng)，而持續(xù)激活的β1-AR導(dǎo)致細(xì)胞代謝和線粒體呼吸異常，這可能是造成線粒體有害物質(zhì)的產(chǎn)生并蓄積進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡、導(dǎo)致心功能不全、心力衰竭發(fā)生的原因[7]。筆者前期研究[8]顯示，β1-AA可以損傷線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

筆者同樣發(fā)現(xiàn)，除心力衰竭患者血清中存在β1-AA外，部分心功能正常的人血清中同樣存在β1-AA[9]，但是β1-AA造成的這種心功能差異機(jī)制不清。因此探尋其機(jī)制，為臨床診療上延緩甚至阻止β1-AA陽(yáng)性人群心功能惡化、緩解甚至逆轉(zhuǎn)心功能不全患者提供了病理生理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

H9c2細(xì)胞系(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)、具有良好生物學(xué)活性的單克隆抗體(β1-AABs)[10]、胎牛血清(FNA500，上海依科賽生物公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(10817014， Corning公司，美國(guó))、胰蛋白酶1∶250(trypsin powder，porcine 1∶250，Sigma-Aldrich公司，美國(guó))、Ⅱ型膠原酶(collagenase type2，Worthington公司，美國(guó))、CCK-8法細(xì)胞增生檢測(cè)試劑盒(KGA317，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)、增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒(S0027，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(C2006，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、96孔不透光發(fā)光板(9502887，Thermo Scientific公司，美國(guó))、BCA蛋白分析試劑盒(SF247582，Thermo Scientific公司，美國(guó))。

1.2 主要儀器

全功能酶標(biāo)儀(Synergy H1，BioTek公司，美國(guó))、化學(xué)發(fā)光儀(Spectramax Molecular Devices公司，美國(guó))、流式細(xì)胞儀(LSRFortessa，BD公司，美國(guó))。

1.3 原代SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs)提取

取數(shù)只新生SD大鼠心臟置于冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中，去除心耳等部位，剪碎并洗去殘留血液。加入適量的胰蛋白酶與Ⅱ型膠原酶混合酶液，37 ℃水浴5 min，將混合液移至含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)上述操作，至組織消化完全。將培養(yǎng)基混濁液850 r/min離心5 min。棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，差速貼壁法獲得所需細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物刺激處理

用含有10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM培養(yǎng)H9c2細(xì)胞至密度為60%～80%，培養(yǎng)NRCMs至第3～4 d時(shí)，加入β1-AA(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)24、36、48 h，檢測(cè)后續(xù)指標(biāo)。

1.5 細(xì)胞生存率檢測(cè)

將新型細(xì)胞增生及毒性檢測(cè)溶液按照10 μL/100 μL培養(yǎng)基加入待測(cè)細(xì)胞中，避光培養(yǎng)1 h后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A值)。細(xì)胞生存率=(加藥細(xì)胞A值-本底A值)/(對(duì)照細(xì)胞A值-本底A值)。

1.6 細(xì)胞ATP含量檢測(cè)

吸除待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基，按照50 μL/孔加入裂解液(24孔板)，充分裂解細(xì)胞后，4 ℃， 12 000g離心 5 min，取上清。配置ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液、ATP檢測(cè)工作液。將工作液加入不透光的檢測(cè)孔板內(nèi)，室溫放置3～5 min。再將待測(cè)樣品、ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液加入檢測(cè)孔板內(nèi)，迅速混勻，使用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)熒光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP含量。BCA法檢測(cè)細(xì)胞裂解液蛋白濃度。最終計(jì)算ATP的濃度(nmol/mg)。

1.7 細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)檢測(cè)

根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置JC-1染色工作液。將待測(cè)細(xì)胞使用胰酶消化并收集至EP管中，加入等量的JC-1染色工作液，充分混勻后繼續(xù)培養(yǎng)20 min。配置JC-1染色緩沖液(1×)，使用此液洗滌細(xì)胞3次。最終使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度β1-AA對(duì)心肌細(xì)胞生存率的改變

與對(duì)照組相比，采用中、高濃度(10-7、10-6mol/L)的β1-AA在不同的時(shí)間刺激，NRCMs生存率皆明顯下降(P<0.05)，其中10-6mol/L β1-AA作用36 h時(shí)最為明顯(0.18 ± 0.01vs1.00 ± 0.00，P<0.05)；其他濃度(10-10、10-9、10-8mol/L)時(shí)，NRCMs生存率與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(圖1A～C)(F24 h=28.57，F(xiàn)36 h=245.29，F(xiàn)48 h=45.80)。提示，中高濃度β1-AA降低乳鼠心肌細(xì)胞(NRCMs)生存率，低濃度β1-AA對(duì)乳鼠心肌(NRCMs)生存率無(wú)明顯影響。

與對(duì)照組相比，β1-AA在中高濃度(10-7及10-6mol/L)作用24 h后，H9c2細(xì)胞生存率下降，并且持續(xù)到48 h(P<0.05)，尤其值得關(guān)注的是，10-6mol/L β1-AA在作用持續(xù)48 h后，與對(duì)照組相比，H9c2細(xì)胞生存率下降尤為顯著(0.07 ± 0.01vs1.00 ± 0.00，P<0.05)；而低濃度(10-10及10-9mol/L)β1-AA刺激36 h及低濃度(10-10及10-8mol/L)刺激48 h后，H9c2細(xì)胞生存率有輕微的增加(P<0.05)，尤其是10-9mol/L β1-AA作用36 h后，與對(duì)照組相比，H9c2細(xì)胞的生存率增加最為明顯(1.24 ± 0.04vs1.00 ± 0.00，P<0.05)(圖2A～C)(F24 h=25.48，F(xiàn)36 h=35.90，F(xiàn)48 h=121.27)。提示：中、高濃度β1-AA降低H9c2細(xì)胞生存率、低濃度β1-AA增加H9c2細(xì)胞生存率。

圖1 不同濃度的β1-AA對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞生存率的改變Fig.1 Different cell survival of NRCMs by β1-AA of different concentrations

A-C: Cell survival was detected by using CCK8 assays after NRCMs were treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 24 h， 36 h and 48 h.*P<0.05vscon group;n=3～6 per group;con: control;NRCMs:neonatal rat cardiomyocytes;β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody.

圖2 不同濃度的β1-AA對(duì)H9c2細(xì)胞生存率的改變Fig.2 Different cell survival of H9c2 cells by β1-AA of different concentrations

A-C: Cell survival was detected by using CCK8 assays after H9c2 cells were treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 24 h， 36 h and 48 h.*P<0.05vscon group，n=3-6 per group，con: control；β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody..

2.2 不同濃度β1-AA對(duì)H9c2細(xì)胞中ATP含量的影響

給予H9c2細(xì)胞不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的β1-AA刺激48 h(因生存率實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)作用時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用48 h時(shí)間點(diǎn))，檢測(cè)其ATP含量。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，高濃度(10-6mol/L)的β1-AA刺激后，H9c2細(xì)胞ATP含量明顯下降(0.15 ± 0.08vs1.00 ± 0.24，P<0.05)；與對(duì)照組相比，采用中、低濃度(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)的β1-AA刺激，H9c2細(xì)胞中ATP含量明顯增加(P<0.05)，尤其10-8mol/L β1-AA作用最為明顯(4.08 ± 0.23vs1.00 ± 0.24，P<0.05)(圖3)(F=21.06)。

圖3 不同濃度的β1-AA引起H9c2細(xì)胞ATP含量改變Fig.3 Different content of ATP of H9c2 cells by β1-AA of different concentrations

The content of ATP was detected by Enhanced ATP Assay Kit after H9c2 cells treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 48 h.*P<0.05vscon group，n=4 per group，con: control；β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody.

2.3 不同濃度β1-AA對(duì)H9c2細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)的影響

給予H9c2細(xì)胞不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的β1-AA刺激48 h，通過(guò)加載JC-1熒光探針、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電勢(shì)(即紅色熒光、綠色熒光、紅色熒光與綠色熒光的比值)改變情況。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，高濃度(10-6mol/L)的β1-AA組的H9c2細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)下降，即紅色熒光降低(0.17 ± 0.14vs1.04 ± 0.02，P<0.05)、綠色熒光增加(5.15 ± 0.56vs0.82 ± 0.07，P<0.05)、紅色/綠色熒光比值降低(0.03 ± 0.03vs1.00 ± 0.07，P<0.05)；與對(duì)照組相比，低濃度β1-AA(10-10、10-8mol/L)組H9c2細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)增高，即紅色/綠色熒光比值增加(10-10mol/L β1-AAvs對(duì)照組：1.95 ± 0.09vs1.00 ± 0.07，P<0.05；10-8mol/L β1-AAvs對(duì)照組：1.71 ± 0.09vs1.00 ± 0.07，P<0.05)(F紅色熒光=36.18，F(xiàn)綠色熒光=46.38，F(xiàn)紅色/綠色熒光比值=30.75)(圖4)。

3 討論

心血管疾病嚴(yán)重危害我國(guó)公眾健康，其終末階段心力衰竭危害最為嚴(yán)重。β-AR在心力衰竭(heart failure，HF)的發(fā)病機(jī)制和治療中的重要性已被廣泛接受[11-12]。而心臟中主要分布β1-AR，β1-AR是G蛋白偶聯(lián)受體，通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)，增加心肌細(xì)胞的收縮性[5]。據(jù)報(bào)道[13]，人體內(nèi)針對(duì)β1-AR的自身抗體(β1-AA)在心力衰竭中發(fā)揮重要作用。

研究[14-15]表明，β1-AA是特異性識(shí)別并結(jié)合β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)(the second extracellular loop of β1-adrenoreceptor，β1-AR-ECII)天然受體構(gòu)象的自身抗體，40%～60%的心功能不全患者血清中存在β1-AA[5]，其可以激活受體及其下游信號(hào)通路，發(fā)揮類激動(dòng)劑樣效應(yīng)[16]，最終造成心肌細(xì)胞損傷、心功能受損[17]。然而，筆者前期研究[9]顯示，除心力衰竭患者血清中存在β1-AA外，部分心功能正常的人血清中存在低水平的β1-AA，那么這是否是造成β1-AA陽(yáng)性者不同心功能的原因呢？為此筆者進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。為還原人體內(nèi)β1-AA持續(xù)作用于心肌細(xì)胞的效果，筆者選取了生物學(xué)活性接近人心肌細(xì)胞的原代SD大鼠乳鼠(出生72 h內(nèi))心肌細(xì)胞(NRCMs)、H9c2細(xì)胞系；在時(shí)間上選擇長(zhǎng)時(shí)間段，以模擬β1-AA在人體血清內(nèi)長(zhǎng)期存在的效應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，β1-AA刺激NRCMs 48 h可以引起凋亡，因此筆者選取24、36、48 h時(shí)間點(diǎn)。筆者發(fā)現(xiàn)10-7、10-6mol/L β1-AA作用于NRCMs、H9c2細(xì)胞后，可以引起其生存率降低，并且隨著濃度增加， 10-6mol/L β1-AA引起的生存率降低更明顯；而且，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，10-7mol/L β1-AA 引起的生存率降低較為明顯，這與“升高的兒茶酚胺激活β1-AR的程度與生存率呈負(fù)相關(guān)”的報(bào)道一致[12]?？赡苁遣糠枝?-AA陽(yáng)性人群心功能異常的原因，即β1-AA長(zhǎng)期中高濃度刺激下心肌細(xì)胞生存率降低、進(jìn)而導(dǎo)致心功能異常。

圖4 高濃度β1-AA引起H9c2細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)下降Fig.4 Decreased mitochondrial membrane potential of H9c2 cells by β1-AA of high concentration

Mitochondrial membrane potential was detected after H9c2 cells was treated by β1-AA (10-10， 10-9， 10-8， 10-7， 10-6mol/L) for 48 h and JC-1 staining.A-F:results of flow cytometry， P3 for red fluorescence and P4 for green fluorescence.G: statistical graph of the red fluorescence;H: statistical graph of the green fluorescence;I: statistical graph of ratio of the red and green fluorescence， representing the mitochondrial membrane potential；*P<0.05vscon group.n=3 per group，con: control;β1-AA:β1-adrenergic receptor autoantibody.

筆者發(fā)現(xiàn)10-10～10-8mol/L β1-AA作用于NRCMs后，其生存率無(wú)明顯改變，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)仍然無(wú)明顯改變，這與心功能正常人群中含有β1-AA陽(yáng)性者的調(diào)查一致。然而低濃度 β1-AA作用于H9c2細(xì)胞36、48 h后有輕微增生，提示低濃度β1-AA可能存在正性作用，這與“異丙腎上腺素(一種β受體激動(dòng)劑)產(chǎn)生正性變力與變時(shí)效應(yīng)”的報(bào)道[18]一致。即低濃度β1-AA對(duì)心肌細(xì)胞存在正性作用、而中高濃度則引起心肌細(xì)胞過(guò)度工作而失代償終致心功能異常。

心臟維持全身各器官、組織充足的血液供應(yīng)，為維持其功能，需要高度耗能，而心肌90%以上的能量來(lái)自于線粒體[19]。ATP在能量代謝中起核心作用，由線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生，其含量可直接反映線粒體功能。有文獻(xiàn)[7]顯示，β1-AR激活會(huì)增加細(xì)胞代謝和線粒體供能，本研究結(jié)果表明，10-10～10-7mol/L的β1-AA 顯著增加H9c2細(xì)胞ATP含量，提示中低濃度β1-AA增加ATP，可能致心肌細(xì)胞收縮功能增加，起到正性肌力作用。10-7mol/L的β1-AA引起細(xì)胞生存率下降，而整體ATP含量仍為增加，提示此濃度下β1-AA引起心肌存活降低，心功能仍然正常，可能是因ATP增加所代償。10-10～10-7mol/L的β1-AA刺激的結(jié)果皆進(jìn)一步解釋了β1-AA陽(yáng)性者人群存在心功能正常的現(xiàn)象。有文獻(xiàn)[7]顯示，β1-AR過(guò)度活化會(huì)增加線粒體有害物質(zhì)產(chǎn)生，進(jìn)而損傷線粒體，最終致心肌細(xì)胞死亡。 10-6mol/L β1-AA刺激結(jié)果說(shuō)明高濃度β1-AA損傷線粒體功能，這也進(jìn)一步提示部分β1-AA陽(yáng)性人群中心功能異常的可能是因?yàn)樾募TP生成明顯減少、最終心臟因能量不足而發(fā)生功能異常。

線粒體膜電勢(shì)(mitochondrial membrane potential，MMP，ΔΨm)是線粒體健康的重要指示因子，因ΔΨm的維持需要線粒體呼吸鏈電子傳遞正常、即線粒體氧化功能正常[20]，也因ΔΨm可以驅(qū)動(dòng)ATP合酶生成ATP、即線粒體磷酸化正常，起到將線粒體氧化與磷酸化偶聯(lián)的重要作用。JC-1是一種常用的ΔΨm檢測(cè)熒光探針，在線粒體膜電位較高時(shí)， JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)， JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體(Monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光；因此通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化，用紅綠熒光的比值來(lái)衡量線粒體去極化程度。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電勢(shì)情況，高濃度(10-6mol/L)的β1-AA嚴(yán)重?fù)p傷線粒體功能(ΔΨm下降)，與細(xì)胞生存結(jié)果、ATP含量結(jié)果一致，提示部分β1-AA陽(yáng)性人群中心功能異常的可能是因?yàn)樾募【€粒體功能障礙、最終心肌細(xì)胞死亡；低濃度(10-10、10-8mol/L)β1-AA刺激使得線粒體膜電勢(shì)增高(10-9、10-7mol/L有增高的趨勢(shì))，與ATP含量的結(jié)果相符，文獻(xiàn)[21-22]報(bào)道，具有高運(yùn)動(dòng)能力的精子都具有更高的線粒體膜電勢(shì)，提示高膜電勢(shì)使得細(xì)胞具有更好的能量?jī)?chǔ)備，低濃度β1-AA刺激使得細(xì)胞因增加膜電勢(shì)而具有較好的能量?jī)?chǔ)備、產(chǎn)生更多的ATP，進(jìn)一步解釋了部分β1-AA陽(yáng)性者心功能正常的現(xiàn)象。

本文利用不同濃度β1-AA長(zhǎng)時(shí)間刺激NRCMs、H9c2細(xì)胞，以模擬β1-AA在不同人群中的心功能表現(xiàn)，以期解釋人群中β1-AA陽(yáng)性者心功能不同的可能原因，為臨床診療提供一定的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，即對(duì)于β1-AA陽(yáng)性人群中心功能異?；颊撸梢圆捎萌コ蚪档脱逯笑?-AA含量，亦可將保護(hù)線粒體功能、維持線粒體膜電勢(shì)、提高ATP生成作為可能的治療方向，對(duì)于心功能正常人群中β1-AA陽(yáng)性者，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)β1-AA濃度和心功能，并且通過(guò)多種方法提高心肌線粒體功能，達(dá)到三級(jí)預(yù)防的效果，以此降低我國(guó)心血管疾病發(fā)病率和致死率，改善人民生活質(zhì)量。