辛明蔚 張 瑩* 何軍琴 楊 維 武 穎 尹曉丹 賈朝霞

(1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100026;2．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院群體保健科，北京 100026)

卵巢功能是決定女性生育能力的重要因素，但是隨著社會進步、工作緊張、壓力加大，卵巢儲備功能下降的發(fā)病率逐年增高且越來越年輕化。卵巢儲備功能下降主要表現(xiàn)為卵巢皮質(zhì)內(nèi)原始卵泡數(shù)量過早耗竭，不能產(chǎn)生足夠多的卵母細(xì)胞或者卵母細(xì)胞質(zhì)量進行性下降，導(dǎo)致激素分泌異常及生育力下降，且流產(chǎn)率和胚胎非整倍體率增加[1-2]。因此揭示卵巢功能減退的機制，建立有效的治療方案，已成為日益增加的臨床需求。近年來，研究[3-4]顯示中醫(yī)藥在促進卵泡發(fā)育、提高妊娠率及降低西藥的不良反應(yīng)等方面具有優(yōu)勢，但其作用機制亟待闡明。本研究借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)本病發(fā)病機制的認(rèn)識及檢測手段，觀察溫腎養(yǎng)血方促卵泡發(fā)育的作用機制，探索中西醫(yī)結(jié)合治療高齡女性不孕癥的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

中藥飲片購自北京同仁堂股份有限公司。溫腎養(yǎng)血方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院趙松泉主任醫(yī)師研制的經(jīng)驗方，其組成為柴胡、香附、木香、赤芍、澤蘭、益母草、牛膝、雞血藤、紅花、丹參、當(dāng)歸、川芎、蒲黃、熟地、淫羊藿、山茱萸、菟絲子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、細(xì)辛、肉蓯蓉等。中藥在首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥制劑實驗室制備，水煎后濃縮成藥液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)，購自以色列Prospec公司，貨號：HOR-272；人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)，購自以色列Prospec 公司，貨號：P139079。

1.2 試驗動物及分組方法

(1)實驗動物：8月齡ICR小鼠體質(zhì)量40 g，購于北京斯貝福實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。采用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為A組：空白組0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液；B組：控制性超排卵組(controlled ovarian hyperstimulation,COH)組；C組：溫腎養(yǎng)血方低劑量組(16.75 g/kg)；D組：溫腎養(yǎng)血方中劑量組(33.5 g/kg)；E組：溫腎養(yǎng)血方高劑量組(67 g/kg)，灌胃藥物劑量為0.2 mL，每組16只。

1.3 給藥方法及取材方法

連續(xù)每日定時(下午6時)灌胃給藥10日，第11天對B、C、D、E組雌鼠同時腹腔注射PMSG 10 IU/只，A、B組雌鼠同時注射等量0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，48 h后，腹腔注射HCG 10 IU/只，14 h后,剖腹取出小鼠卵巢及輸卵管，以無菌TB針輕輕劃破輸卵管壺腹部收集卵丘復(fù)合物，立即以80 IU/mL的透明質(zhì)酸酶處理卵丘復(fù)合物，剔除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，用吸卵管反復(fù)吹打后，對去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞在顯微鏡下記數(shù)，進行形態(tài)學(xué)觀察，并計算每只小鼠超排卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)。

1.4 生育質(zhì)量觀察指標(biāo)

在給藥前及給藥期間每天記錄每只小鼠的體質(zhì)量，進行統(tǒng)計學(xué)分析。記錄小鼠的卵母細(xì)胞數(shù)量和優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)量。優(yōu)質(zhì)卵泡判定標(biāo)準(zhǔn)：卵母細(xì)胞形狀周正，邊緣清晰、平滑，細(xì)胞內(nèi)部均勻透亮。每組記錄4只雌鼠與雄鼠交配后的產(chǎn)仔數(shù)量。

1.5 qRT-PCR法檢測小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA的表達

將卵巢組織置于0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液的DEPC水中，采用電動組織研磨器低溫研磨，采用動物組織總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP431)提取RNA，采用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR106)進行反轉(zhuǎn)錄，然后采用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒(北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)P205)進行qRT-PCR反應(yīng)：在20 μL體系中加入 12.5 μL PCR Mix上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，置于熒光定量PCR儀中(ABI7300)，95 ℃ 5 min 預(yù)變性，95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，在72 ℃采集熒光信號，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCT法計算PI3K、AKT和FOXO3a mRNA的相對表達量。引物序列：PI3K：上游：5′-CCACGACCATCTTCGGGTG-3′；下游：5′-GGGGAGTAAACATTCCACTAGGA-3′；AKT：上游：5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′；下游：5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′；FOXO3a：上游：5′-ATGGCAGAGGCACCAGCC-3′，下游：5′-CAAAGCTGGGTACCAGGCTGA-3′ (由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成)。

1.6 Western blotting法檢測小鼠卵巢PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a蛋白表達

取-80 ℃保存的卵巢組織，經(jīng)冰冷的PBS 充分洗滌后置入玻璃勻漿器中，然后加入預(yù)冷的蛋白裂解液研磨成勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，-80 ℃保存。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每個泳道上樣 100 μg。濃縮膠80 V電泳20 min，分離膠120 V電泳2 h；然后100 V恒壓轉(zhuǎn)膜 1.5 h至PVDF膜。5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h。4 ℃孵育一抗過夜，二抗(1∶5 000 稀釋)37 ℃ 1 h。TBST 洗膜3次，每次10 min，發(fā)光液曝光30 s～5 min，凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行采集和分析。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測卵巢組織中PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a蛋白表達

取卵巢組織，浸泡于10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛固定，再先后進行脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制備組織蠟塊；然后經(jīng)切片、脫蠟、水化、熱修復(fù)，3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2溶液阻斷，加抗體(PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、FOXO3a、P-FOXO3a抗體濃度均為 1∶200)，加生物素化山羊抗小鼠 IgG(兔)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化、返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。高倍鏡下(400×)隨機選取5個視野，Image J軟件測量陽性區(qū)域平均吸光度值，取5個視野的平均值作為所測指標(biāo)的蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 溫腎養(yǎng)血方對小鼠體質(zhì)量的影響

各組小鼠體質(zhì)量變化見表1。給藥過程中，溫腎養(yǎng)血方對各組小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 排卵數(shù)及生育結(jié)果

B組、C組、D組和E組的排卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)均明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；C組和D組的排卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)均明顯高于E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；不同給藥組小鼠的生育個數(shù)趨勢與排卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)變化的趨勢相一致，C組和D組的生育數(shù)均高于E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的變化Tab.1 Body weight changes in different groups of mice

A:blank group;B:controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

表2 不同給藥組小鼠排卵及生育結(jié)果Tab.2 Number of follicle and high quality follicle in different administration groups of mice

*P<0.01vsgroup A;#P<0.01vsgroup E.A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

2.3 溫腎養(yǎng)血方對ICR小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA水平的影響

由圖1可知，與A組比較，D組PI3K mRNA的表達下降，在C、E組的表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組、C組AKT mRNA的表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B、C、D、E組的FOXO3a mRNA表達均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著中藥濃度升高，F(xiàn)OXO3a mRNA表達的含量逐漸下降。

2.4 溫腎養(yǎng)血方對ICR小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路蛋白水平的影響

與A組相比，D組的P-PI3K、PI3K表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E組和A組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組和C組P-AKT、AKT表達水平升高，隨著溫腎養(yǎng)血方給藥濃度的上升，逐漸下降接近空白組水平；P-FOXO3a、FOXO3a在B組、C組、D組表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并有隨著給藥濃度的增加逐漸降低的趨勢，詳見圖2。

2.5 免疫組織化學(xué)檢測溫腎養(yǎng)血方對ICR小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路的影響

小鼠卵巢中磷酸化和非磷酸化的PI3K和FOXO3a的蛋白表達水平變化趨勢與qRT-PCR法和Western blotting法檢測結(jié)果基本一致。與A組相比，D組的P-PI3K、PI3K表達量均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；C組和E組與A組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與A組相比，B組P-AKT的表達量明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；D組P-AKT的表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組和E組與A組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與A組相比，B組和E組AKT的表達量明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；C組和D組與A組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與A組相比，B組、C組和D組P-FOXO3a、FOXO3a的表達量均明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E組與A組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3，圖3～8。

圖1 溫腎養(yǎng)血方對小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3a mRNA水平的影響Fig.1 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on PI3K,AKT,FOXO3a mRNA level in mouse ovaries

*P<0.01vsgroup A;A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:middle dose group;E:high dose group.

表3 溫腎養(yǎng)血方對小鼠免疫組織化學(xué)結(jié)果的影響Tab.3 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on immunohistochemical results of mice

*P<0.05,**P<0.01vsgroup A.A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:middle dose group;E:high dose group;n=16 for each group.

圖2 溫腎養(yǎng)血方對小鼠卵巢PI3K-AKT-FOXO3a通路蛋白水平的影響Fig.2 Effects of Wenshen Yangxue Decoction on the protein levels of PI3K-AKT-FOXO3a pathway in mouse ovaries

*P<0.05vsgroup A;A:blank；B: controlled ovarian hyperstimulation；C:low dose；D:mid dose；E:high dose.

圖3 ICR小鼠卵巢P-PI3K免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.3 Results of ICR mouse ovarian P-PI3K immunohistochemistry(200×)

A:blank group;B: controlled ovarian hyperstimulation group;C:low dose group;D:mid dose group;E:high dose group.

圖4 ICR小鼠卵巢PI3K免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.4 Results of ICR mouse ovarian PI3K immunohistochemistry(200×)

圖5 ICR小鼠卵巢P-AKT免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.5 Results of ICR mouse ovarian P-AKT immunohistochemistry(200×)

圖6 ICR小鼠卵巢AKT免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.6 Results of ICR mouse ovarian AKT immunohistochemistry(200×)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為高齡卵巢儲備功能下降的主要原因在于腎。腎藏精，主生殖，“兩精相博，合而成形”，胚胎的形成依賴于男女雙方的先天生殖之精。卵母細(xì)胞是能否成功受孕的一個決定性的因素。女子又以肝為先天，肝藏血，肝腎同源，精血互生。張俊博等[5]基于聚類分析對高齡女性不孕癥的中醫(yī)證候規(guī)律進行了探討，結(jié)果顯示，高齡女性不孕癥基本病機以腎虛、血瘀為主。女性進入“五七”之后，生殖能力逐漸下降，腎精漸衰。腎精不足而則肝血不充，肝腎精血虧虛日久而致氣虛，氣虛無力推動血液的運行，而致血瘀，血瘀日久而新血不生，不足以濡養(yǎng)卵泡。本研究中溫腎養(yǎng)血方以溫腎填精、活血養(yǎng)血為治法，熟地、肉蓯蓉、鹿角、淫羊藿等為滋補要藥，滋腎陰補腎陽，陰陽并補；菟絲子、枸杞子、覆盆子、山茱萸等肝腎同補，配伍柴胡、香附、紅花、丹參、川芎、當(dāng)歸、赤芍、益母草、澤蘭、雞血藤蒲黃等疏肝行氣、活血養(yǎng)血之品，全方陰陽氣血并補，兼行氣活血，使本固血充，氣暢血行，促進卵泡的發(fā)育，從而改善卵巢功能。

圖7 ICR小鼠卵巢P-FOXO3a免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.7 Results of ICR mouse ovarian P-FOXO3a immunohistochemistry(200×)

圖8 ICR小鼠卵巢FOXO3a免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.8 Results of ICR mouse ovarian FOXO3a immunohistochemistry(200×)

PI3K-AKT 信號通路與細(xì)胞增生、分化密切相關(guān)，在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均存在完整的 PI3K-AKT 信號系統(tǒng)，它們共同調(diào)節(jié)著卵泡的生長發(fā)育、成熟和排卵，能預(yù)測卵母細(xì)胞質(zhì)量[6]。在卵母細(xì)胞中，PI3K-AKT 信號通路對于卵泡的激活具有階段特異性，對始基卵泡的發(fā)育起決定性作用[7]，可調(diào)控始基卵泡的發(fā)育和生長、顆粒細(xì)胞的增生和分化等過程[8]。PI3K可引起AKT蛋白磷酸化，活化后的AKT可通過調(diào)控線粒體蛋白釋放和細(xì)胞周期等途徑促進細(xì)胞增生、分化和抗凋亡。因此，PI3K信號通路的活性以下游的P-AKT 表達水平為代表。AKT的功能與PI3K相似，可刺激細(xì)胞生長。本研究結(jié)果顯示COH組和低劑量組P-AKT的蛋白表達水平高于其他組，之后隨著溫腎養(yǎng)血方給藥濃度的上升，P-AKT蛋白表達水平恢復(fù)至接近空白組水平；AKT mRNA的表達水平在中藥低劑量組最高，溫腎養(yǎng)血方能調(diào)控高齡小鼠PI3K、P-PI3K和AKT、P-AKT的含量。

FOXO家族成員是PI3K-AKT通路的主要效應(yīng)蛋白，PI3K-AKT通過作用于FOXO蛋白上的磷酸化位點來控制其活性，影響FOXO下游一系列與細(xì)胞增生、凋亡及周期阻滯相關(guān)基因的表達[9]。Schneider等[10]發(fā)現(xiàn)FOXO3a基因可能是抑制原始卵泡過度活化的重要調(diào)控因子，可以避免鼠原始卵泡過度耗竭、延長卵巢儲備和生育能力[11-12]，其持續(xù)表達會導(dǎo)致卵母細(xì)胞及卵泡發(fā)育遲緩，從而顯著減少卵母細(xì)胞體積[13]，而降低FOXO3a基因表達卻能增加鼠靜息卵巢儲備[14-15]。當(dāng)某些分子作用卵泡后，PI3K通路激活，使FOXO3a磷酸化，磷酸化的FOXO3a進入胞質(zhì)，失去活性，卵泡開始發(fā)育。本研究結(jié)果顯示在COH組中P-FOXO3a和FOXO3a的表達量最高，顯著高于空白組，隨著中藥組給藥濃度增加，P-FOXO3a和FOXO3a的表達量逐漸降低，F(xiàn)OXO3a在高劑量組則降至接近與空白組的水平，表明溫腎養(yǎng)血方可以通過調(diào)節(jié)FOXO3a的表達量提高卵巢儲備功能、促進卵泡發(fā)育。

綜上所述，以上結(jié)果初步證明了溫腎養(yǎng)血方能夠促進高齡雌鼠卵泡發(fā)育，增加排卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)及生育數(shù)量，其作用機制可能與調(diào)節(jié)PI3K、AKT和FOXO3a的表達有關(guān)。溫腎養(yǎng)血方低劑量和中劑量效果最好，高劑量次之，可能與中藥濃度增加同時調(diào)控了其他相關(guān)因子的表達有關(guān)，其具體機制仍需進一步探討。