趙魯卿 常雄飛 張聲生*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院消化中心，北京 100010；2.北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院脾胃病科，北京 101300)

功能性消化不良(functional dyspepsia， FD)是臨床最常見的消化系統(tǒng)疾病，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，但病情反復(fù)遷延，耗費(fèi)大量的醫(yī)療資源[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，消化不良癥狀主要由胃產(chǎn)生，近年來(lái)越來(lái)越多的研究[2-3]表明，十二指腸黏膜屏障受損在FD發(fā)生的病理生理過(guò)程中起著非常重要的作用，而緊密連接是十二指腸機(jī)械屏障的重要組成部分，對(duì)于黏膜屏障功能的發(fā)揮至關(guān)重要。目前本病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床西醫(yī)沒(méi)有特效藥物，多以臨時(shí)緩解癥狀為主，中醫(yī)藥通過(guò)整體調(diào)節(jié)和辨證論治，對(duì)于本病具有良好療效。FD屬中醫(yī)“痞滿”、“胃脘痛”范疇，本病病位在胃，主要涉及肝、脾二臟?！案纹⑾嚓P(guān)”理論在本病機(jī)制中尤為重要，肝為發(fā)病的重要因素，脾則為發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，肝郁則氣滯，脾損多脾虛，“脾虛氣滯”是 FD的主要病理機(jī)制，本科結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制中藥健脾理氣方，前期通過(guò)大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照研究[4]顯示，該方可明顯改善 FD 患者的消化道癥狀。并且，本研究前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明健脾理氣方可以修復(fù)FD 大鼠十二指腸緊密連接蛋白表達(dá)，但該作用涉及的信號(hào)通路尚不清楚。

研究[5-6]顯示，肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase， MLCK)和前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)及其受體1(EP1)和4(EP4)介導(dǎo)的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate， cAMP)/激酶A(protein kinase A，PKA)通路是影響緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能的重要因素。本研究擬從以上兩通路著手探討健脾理氣方可能的作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，從分子生物學(xué)水平為中醫(yī)藥的推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物

由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院草藥房提供(所有藥材均從北京杏林藥業(yè)公司購(gòu)入)，制備水煎劑，簡(jiǎn)要過(guò)程如下：按健脾理氣方組成(黨參、茯苓、炒白術(shù)、姜厚樸、砂仁、元胡等)稱取藥物，每付共計(jì)91 g，加入蒸餾水1 500 mL，浸泡30 min，大火將水煮沸，煎煮約30 min，將藥汁倒出盛入容器中，再次加入1 500 mL蒸餾水，煎煮第二遍，將兩次的藥液合并混勻，濃縮至95 mL，計(jì)算其生藥含量為0.96 g/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入SPF級(jí)雄性SD大鼠(200±20)g 18只，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)研究院基礎(chǔ)所屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0021。所有動(dòng)物都在恒濕(65%～70%)、恒溫(22±1) ℃環(huán)境下飼養(yǎng)，每日光照12 h，所有動(dòng)物均可自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始進(jìn)行造模。

1.3 試劑及儀器

CFX 96 PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，GoScript Reverse Transcription System( Promega公司，美國(guó)) 、GoTaq Qpcr Master Mix( Promega公司，美國(guó))、Trizol Reagent(Cat15596-026)、cAMP Elisa試劑盒(BlueGene公司，中國(guó))、PGE2 Elisa試劑盒(E02P0012，BlueGene公司，中國(guó))、酶標(biāo)儀(EON，BioTek instruments公司，美國(guó))等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組

將18只SD雄性大鼠采用數(shù)字表法按照1∶2比例隨機(jī)分為正常組6只、造模組12只。造模完成后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組及健脾理氣方治療組，每組6只。

1.4.2 造模方法

采用目前國(guó)內(nèi)公認(rèn)的FD造模方法，即夾尾造模方法，具體操作如下：將造模組大鼠5只一籠分籠，用長(zhǎng)柄海綿鉗夾緊大鼠尾巴遠(yuǎn)端1/3處，使其暴躁惱怒，并且與同籠大鼠廝打，使整籠大鼠始終處于應(yīng)激狀態(tài)。每次刺激持續(xù)30 min，每3 h刺激1次，每日刺激4次，連續(xù)刺激1周。造模期間，如果發(fā)現(xiàn)大鼠尾巴有破損，需要用碘酊對(duì)破損部位進(jìn)行消毒，防止感染。

1.4.3 灌胃給藥

參照《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[7]中動(dòng)物給藥劑量規(guī)范，換算出大鼠給藥劑量為9.6 g·kg-1·d-1，即每100 g體質(zhì)量大鼠，給藥量為1 mL。造模完成后，給予正常組及FD模型組大鼠0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液灌胃，每100 g體質(zhì)量大鼠灌胃1 mL，而治療組大鼠給予健脾理氣方水煎劑灌胃，每100 g體質(zhì)量大鼠灌胃1 mL。每日早晨8點(diǎn)準(zhǔn)時(shí)灌胃，每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

1.4.4 取材

實(shí)驗(yàn)前24 h，將各組大鼠均禁食(不禁水)。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將各組大鼠腹腔注射2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉麻醉，后逐層剪開皮膚、肌肉，暴露十二指腸，剪取大鼠幽門下0.5 cm后約3 cm的十二指腸組織，按實(shí)驗(yàn)方法的不同對(duì)新鮮組織進(jìn)行處理：①置于 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定；②完全浸泡在RNA保護(hù)液中，保存于-80 ℃中備用；③放入凍存管，置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于ELISA檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 HE染色

剪取大鼠十二指腸組織，置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定，脫水、包埋、切片，厚度 8 μm; 用二甲苯溶液脫蠟，依次進(jìn)行蘇木精及伊紅染色液染色，經(jīng)二甲苯透明后使用中性樹膠封片。

1.5.2 qPCR

取大鼠十二指腸組織，Trizol 法提取組織總RNA，按照 GoScript Reverse Transcription System 試劑盒說(shuō)明書將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后按照 GoTaq Qpcr Master Mix 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行 qPCR 反應(yīng): 95 ℃預(yù)變性2 min，隨后進(jìn)行40 個(gè)循 環(huán): 95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火/延伸 60 s。采用 2-ΔΔCt進(jìn)行 RNA 相對(duì)表達(dá)量分析。MLCK 上游引物: 5′-GACGTGTTCACCCTGGTTCT-3′，下游引物5′-TTTGTGCAGCATCAGTGACA-3′；EP1上游引物：5′-ACTTGGTGTTTCATTAGCCTT-3′，下游引物：5′-GGCCGCTGCAGGGAGTTAGAG-3′，EP4上游引物: 5′-TCTCTGGTGGTGCTCATCTG-3′，下 游 引 物: 5′-ATTCTGATGGCCTGCAAATC-3′。

1.5.3 ELISA法

將十二指腸組織從-80 ℃冰箱中迅速取出，剪刀迅速剪碎，加入500 μL預(yù)冷PBS溶液，置于自動(dòng)勻漿機(jī)中進(jìn)行組織研磨勻漿；使用低溫離心機(jī)，4 ℃，10 000g離心10 min，取上清液為待測(cè)樣品；將適量待測(cè)樣品用于BCA蛋白定量，得出待測(cè)樣品蛋白濃度( μg/μL)。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠十二指腸形態(tài)學(xué)比較

HE染色顯示，治療結(jié)束時(shí)3組大鼠十二指腸上皮黏膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯炎性反應(yīng)表現(xiàn)，詳見圖1。

圖1 三組大鼠十二指腸組織形態(tài)Fig.1 Morphology of duodenum(HE staining，100×)A：normal group; B:model group; C:JPLQ group; JPLQ:Jianpi Liqi.

2.2 三組大鼠十二指腸MLCK mRNA表達(dá)水平

模型組大鼠十二指腸MLCK的mRNA含量較正常組明顯升高(P<0.01)，而健脾理氣方治療后，其mRNA含量明顯下降(P<0.01)，詳見表1。

表1 大鼠十二指腸MLCK mRNA表達(dá)量Tab.1 mRNA expression of MLCK in the duodenum

F=15.943，P=0.000；**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group;MLCK:myosin light chain kinase;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.3 三組大鼠十二指腸PGE2含量

與正常組相比，模型組大鼠十二指腸的PGE2含量明顯下降(P<0.01)，而經(jīng)過(guò)健脾理氣治療后，其PEG2含量得到明顯升高(P<0.01)，詳見表2。

表2 大鼠十二指腸PGE2含量Tab.2 Concentration of PGE2 in the duodenum

F=28.031，P=0.000；**P<0.01vsnormal group ;##P<0.01vsmodel group;PGE2:prostaglandin E2;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.4 三組大鼠十二指腸EP1和EP4 mRNA表達(dá)

PGE2受體有EP1-EP4四種亞型，其在消化道中均有表達(dá)，而PGE2主要通過(guò)EP1與EP4受體對(duì)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)起到調(diào)控作用。研究結(jié)果顯示，EP1 mRNA的表達(dá)在3組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而EP4 mRNA模型組的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，治療組明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 大鼠十二指腸EP1/EP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.3 mRNA expression of EP1 and EP4 in the duodenum

*P<0.05vsnormal group ;#P<0.05vsmodel group;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.5 三組大鼠十二指腸cAMP含量

模型組大鼠十二指腸cAMP含量相較于正常組顯著降低(P<0.01)，而治療組大鼠cAMP含量顯著升高(P<0.01)，詳見表4。

表4 大鼠十二指腸cAMP含量Tab.4 Concentration of cAMP in the duodenum

F=45.593，P=0.000；**P<0.01vsnormal group ;##P<0.01vsmodel group;cAMP：cyclic adenosine monophosphate；JPLQ:Jianpi Liqi.

3 討論

FD由于發(fā)病機(jī)制并不明確，目前沒(méi)有特效藥物。中醫(yī)認(rèn)為脾與胃相表里， 五行屬土，主受納運(yùn)化水谷。肝在五行屬木，主疏泄， 條暢全身之氣機(jī)?！笆硽馊胛?， 全賴肝木之氣疏泄之， 而水谷乃化”， “脾土賴肝木之疏達(dá)之性，肝木亦靠脾土灌溉而升?！彼紤]太過(guò)則肝氣郁滯， 疏泄不及則脾胃升降之氣也因之而壅阻，雍滯日久則脾氣虛損，功能失司，而見諸癥。因此脾虛氣滯是本病的核心病理環(huán)節(jié)，治法以健脾和胃，理氣止痛為主。健脾理氣方由黨參、茯苓、炒白術(shù)、姜厚樸、砂仁、元胡等組成，諸藥配伍補(bǔ)消兼施，升降有制，既能健運(yùn)脾胃又可調(diào)理氣機(jī)，虛可補(bǔ)，滯可行，共奏健脾和胃、理氣止痛之效，該方臨床療效確切，但是作用機(jī)制并不明確。近年來(lái)，十二指腸黏膜屏障受損等關(guān)于FD的新的發(fā)病機(jī)制被提出，“脾為之衛(wèi)”，脾虛則衛(wèi)外功能失司，就消化道而言與現(xiàn)代腸道黏膜屏障功能理論相吻合。十二指腸是否是中醫(yī)藥作用的靶點(diǎn)，目前研究較少。

研究[2]表明，F(xiàn)D 患者十二指腸跨上皮電阻抗較低，細(xì)胞旁通透性增加，提示十二指腸黏膜完整性受損。緊密連接是十二指腸黏膜上皮細(xì)胞之間的主要連接方式，對(duì)上皮細(xì)胞屏障功能的正常發(fā)揮起著重要作用[4]。緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和功能受多條通路調(diào)節(jié)。MLCK屬于鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶家族，在鈣和鈣調(diào)蛋白存在下，MLCK對(duì)肌球蛋白輕鏈進(jìn)行磷酸化作用，并促進(jìn)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間相互作用，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白收縮，進(jìn)而破壞細(xì)胞間緊密連接，引起細(xì)胞通透性升高[5，8]。該研究結(jié)果顯示，健脾理氣方可以降低FD大鼠十二指腸MLCK mRNA表達(dá)量。PGE2具有保護(hù)腸道緊密連接屏障的作用[9]，既往的基礎(chǔ)研究[10-11]顯示，PGE2對(duì)十二指腸緊密連接蛋白表達(dá)的調(diào)控，主要通過(guò)與EP1及EP4結(jié)合起作用。PGE2與其受體結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)cAMP含量升高，PKA則由cAMP激活，對(duì)緊密連接蛋白裝配以及上皮細(xì)胞旁通路的開放具有調(diào)節(jié)作用[12]。結(jié)果顯示，健脾理氣方可以提高FD大鼠十二指腸PGE2和cAMP的表達(dá)，提高EP4的mRNA表達(dá)量。前期相關(guān)藥理研究[13-14]結(jié)果顯示，健脾理氣方中藥物有效成分白術(shù)多糖可以修復(fù)腸道黏膜屏障[13]，甘草總黃酮可以促進(jìn)PGE2分泌[14]。

綜上所述，健脾理氣方抑制MLCK，激活PGE2-EP4-cAMP/PKA信號(hào)通路，進(jìn)一步改善FD模型大鼠十二指腸緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能，恢復(fù)十二指腸黏膜屏障功能，可能是其治療FD 的作用機(jī)制之一。