陳玉靜 陳文強 張建新 劉 妍 吳犀翎 王建東 黃小波*

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院中醫(yī)科，北京市中西醫(yī)結合老年疾病研究所，北京 100053; 2.山東省夏津縣人民醫(yī)院內科，山東德州 253200 )

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)與血管性癡呆(vascular dementia，VD)是老年期認知功能損害的兩個主要臨床類型。慢性腦低灌注是AD與VD共有的重要病理學基礎[1]，近年研究[2]表明，自噬作為細胞受到刺激后，通過溶酶體途徑完成自身代謝和細胞器更新的重要方式，與β-淀粉樣蛋白 (amyloid β-protein， Aβ)的聚集和AD的發(fā)病密切相關。中藥黃芩為唇形科植物黃芩的根，味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。黃芩甙是從黃芩的根莖中分離純化得到的一種黃酮類單體化合物，也是黃芩的主要有效成分，黃芩甙具有多種生物活性和功效，如抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜、神經保護、抗凋亡、增強機體免疫力以及抑菌作用等[3-4]。本研究通過觀察黃芩甙對慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)大鼠模型認知障礙的改善作用及其對自噬通路的影響，為開發(fā)治療血管性認知功能損害的有效中藥提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體質量(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物中心(合格證號：SCXK京2007-0001)。

1.1.2 藥品及主要試劑

黃芩甙(濃度>95%)購自美國Sigma公司，LC-3Ⅱ和Beclin-1抗體購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備、分組及給藥

SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和黃芩甙低、中、高3個劑量組，每組各10只。

慢性腦低灌注大鼠模型的建立：參考文獻方法[5]，SD大鼠自購回后適應性飼養(yǎng)1周，術前禁食，以1.5%(質量分數(shù))戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸部備皮，常規(guī)碘伏消毒，頸部正中縱向切口，暴露氣管及胸鎖乳突肌，小心輕柔分離一側頸總動脈與周圍組織、迷走神經等，避免拉扯，手術縫線進行血管上下端結扎后離斷血管，縫合肌肉、筋膜及皮膚后肌注青霉素抗感染。7 d后，結扎對側。對照組僅分離雙側頸總動脈，不進行結扎與離斷，保證其他操作相同。術后l周起給予對照組、模型組大鼠腹腔注射等滲0.9%(質量分數(shù))氯化鈉注射液，治療組使用黃芩甙分別按照60、120、240 mg·kg-1·d-1的劑量進行腹腔注射，共4周。

1.2.2 Morris水迷宮行為學測試

參照Morris水迷宮法進行定向航行實驗和空間探索實驗[6]，歷時6 d。定向航行實驗評估空間學習能力，空間探索實驗評估空間記憶能力。在1～5 d進行定向航行實驗，即每日將大鼠在同一象限入水點靠池壁放入水中，記錄120 s內大鼠從入水到爬上對角線象限的站臺所需時間和路線，即逃避潛伏期以及搜索距離，每只大鼠訓練2次/d。第6天進行空間探索實驗，即撤去站臺，將大鼠從原入水點放入水池，記錄120 s內大鼠在原站臺象限游泳的時間。

1.2.3 Western blotting檢測LC-3Ⅱ和Beclin-1表達

大鼠斷頭后于冰上取腦，用冷PBS漂洗殘余血后，分離海馬，提取蛋白質，定量，用蛋白酶抑制劑將各樣品調整成等體積含相同蛋白濃度的樣品，配制15%(質量分數(shù))分離膠，4%(質量分數(shù))的濃縮膠， 30 μg蛋白的樣品上樣，100 V電壓電泳75 min，97 V電壓PVDF膜轉膜90 min，室溫下封閉1 h，LC-3 Ⅱ(1∶1 000)和Beclin-1(1∶1 000)4 ℃ 過夜，TBST洗5 min×3次，二抗(1∶5 000)室溫下1 h，TBST洗5 min×3次，進行化學發(fā)光反應、曝光、拍照，分析目標帶的相對分子質量和吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 黃芩甙對大鼠學習記憶能力的影響

2.1.1 定位航行實驗

記錄大鼠搜索并找到逃避平臺的逃避潛伏期及搜索距離，結果詳見表1和表2。在測試的5 d內所有大鼠的潛伏期都呈現(xiàn)下降趨勢。自第2天起，模型組較對照組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，搜索距離增加(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，顯示由于慢性腦低灌注而導致學習記憶功能下降。黃芩甙干預組自第3天起，逃避潛伏期和搜索距離均較模型組縮短(P<0.05，P<0.01)差異有統(tǒng)計學意義，其中以中、高劑量組更為顯著。

表1 定向航行實驗中各組平均逃避潛伏期比較Tab.1 Comparison of the average escape latency in place navigation test

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group

表2 定向航行實驗中各組游泳距離比較Tab.2 Comparison of the swimming distance in place navigation test

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group

2.1.2 空間探索實驗

觀察撤臺后大鼠在原平臺所在象限停留時間，結果詳見表3。與對照組相比，模型組大鼠在原平臺所在象限搜索時間縮短(P<0.01)，黃芩甙各劑量組大鼠在原平臺所在象限搜索時間均較模型組延長 (P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義?？臻g探索實驗的測試結果表明，黃芩甙在一定程度上可以緩解記憶功能損傷。

表3 各組空間探索實驗比較Tab.3 Results of spatial probe test

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsmodel group

2.2 黃芩甙對大鼠海馬LC-3Ⅱ、Beclin-1表達的影響

模型組中LC-3Ⅱ和Beclin-1表達較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。黃芩甙干預后海馬內LC-3Ⅱ和Beclin-1表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。詳見圖1，表4。

圖1 Western blotting檢測各組海馬LC-3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達Fig.1 Western blotting expression of LC-3Ⅱ and Beclin-1

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group;1:control group;2: model group;3: low-dose baicalin group;4: medium-dose baicalin group;5: high-dose baicalin group.

表4 黃芩甙對大鼠海馬LC-3Ⅱ、Beclin-1表達的影響Tab.4 Effects of baicalin on expression of LC-3Ⅱ and Beclin-1 in hippocampal of rats

3 討論

隨著生活水平的提高、生活方式的改變以及老齡人口的增多，癡呆與認知功能損害的發(fā)病率有增高的趨勢。AD與VD是老年期認知功能損害的兩個主要臨床類型，近年來大量研究[7-8]顯示，AD和VD患者的影像學都表現(xiàn)出腦組織低灌注。慢性腦低灌注是一種常見的臨床病理現(xiàn)象，見于多種腦血管疾病的病理發(fā)生過程中，實驗研究[9-10]也顯示慢性腦低灌注可導致多種神經遞質的失衡，使腦組織發(fā)生神經炎性反應、氧化應激，破壞血腦脊液屏障，造成免疫損傷，并且使腦組織處于隱性能量代謝障礙狀況，造成樹突形態(tài)和密度的變化，進而導致認知功能下降。海馬是腦內缺血性損傷的最敏感區(qū)域，慢性腦低灌注可能通過多方面來影響海馬的學習和記憶過程，導致認知功能障礙的發(fā)生和發(fā)展。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質等有害大分子物質的重要途徑。正常老化伴隨著自噬小泡聚集及自噬功能的障礙[11]，在此過程中，Beclin-1啟動自噬小體[12]，LC3B參與了自噬形成及成熟過程[13]。LC3-Ⅰ經剪切、脂化、與磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3B-Ⅱ[14]。自噬泡的形成以LC3B-Ⅱ從膜的外表面釋放為標志，LC3B-Ⅱ表達增加通常被認為是自噬泡形成增加、自噬活性增加的證據(jù)[15]。自噬本身具有兩面性，一方面自噬可以清除胞內有害和過剩的細胞器以及病原體，另一方面自噬的過度激活可以導致細胞的程序性凋亡，從而引起一系列疾病過程[16]。有研究[17]顯示，自噬參與了慢性腦低灌注的發(fā)生，并且在認知功能減退之前腦內自噬系統(tǒng)就已經發(fā)生改變。有文獻[17-18]顯示慢性腦低灌注發(fā)生4周時，LC-3Ⅱ和Beclin-1表達增加，并且自噬泡中富含淀粉樣前體蛋白、Aβ及γ-分泌酶，誘導自噬可引起Aβ增多，因此自噬泡被認為是Aβ產生的場所。隨著低灌注時間的延長，自噬持續(xù)激活且降解能力持續(xù)下降，即使腦血流部分恢復，慢性腦低灌注導致的海馬神經元損傷卻持續(xù)加重。

本研究顯示慢性腦低灌注模型組LC-3Ⅱ和Beclin-1的表達增多，說明慢性腦低灌注激活了體內自噬系統(tǒng)，造成海馬神經元損傷；黃芩甙干預組，自噬標志蛋白 LC-3Ⅱ和Beclin-1表達量明顯降低，表明黃芩甙可抑制自噬的表達，進而保護了海馬神經元。

近年來研究[19]顯示黃芩甙可直接作用于中樞神經系統(tǒng)的神經元細胞，對出血性、缺血性腦損傷以及中樞神經系統(tǒng)感染性腦損傷具有廣泛的保護作用，此外，黃芩甙能夠促進AD模型大鼠內源性神經干細胞的增生和分化[20]，在神經免疫方面，黃芩甙通過抑制膠質細胞的激活和促進腫瘤壞死因子-α和重組人白介素-6的表達，緩解Aβ1-42帶來的病理損害[21]。本研究應用Morris水迷宮試驗進行學習、記憶能力的測試，觀察各組大鼠的認知功能狀況。結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長、跨越平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.01)，提示慢性腦低灌注大鼠的學習、記憶能力明顯降低。而黃芩甙干預組大鼠的逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)明顯多于模型組(P<0.05，P<0.01)，提示用黃芩甙干預能明顯改善慢性腦低灌注大鼠的學習、記憶能力，猜測也許與其抑制自噬相關蛋白的表達有關。

綜上所述，黃芩甙能夠縮短慢性腦低灌注模型組大鼠找到平臺的游泳路徑，降低海馬神經元自噬標志蛋白 LC-3Ⅱ和Beclin-1的表達，從而對慢性腦低灌注模型學習記憶起到改善作用，是否有其他因素參與了黃芩甙改善認知障礙的過程，尚需更深層次的研究。