劉 妍 陳玉靜 陳文強 黃小波

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100053)

近年來研究[1-3]顯示在癡呆常見的類型中，不論是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 還是血管性癡呆 (vascular dementia, VD) 患者，在影像學方面都表現(xiàn)出腦組織的低灌注[1]。慢性腦低灌注在老年人中普遍存在，當慢性腦低灌注發(fā)生后腦組織出現(xiàn)氧和葡萄糖供應不足，進而出現(xiàn)一系列的穩(wěn)態(tài)改變，包括氧化應激、凋亡、自噬等，導致與認知功能相關(guān)的區(qū)域發(fā)生神經(jīng)細胞死亡，并逐漸表現(xiàn)出認知功能的障礙，而海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡與認知功能的障礙有著尤為密切的關(guān)系[2]。本課題組前期研究[3]顯示具有安神益智、開竅醒神功效的對藥遠志和石菖蒲，能夠改善糖尿病認知障礙大鼠的學習記憶能力，保護海馬神經(jīng)元。因此本研究選用由遠志和石菖蒲組成的遠志湯對慢性腦低灌注大鼠進行干預，研究遠志湯是否通過調(diào)控海馬凋亡相關(guān)蛋白B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白抗體(Bcl-2 associated X protein, Bax)及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)，而起到保護海馬神經(jīng)元，改善慢性腦低灌注大鼠學習記憶能力的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級雄性SD大鼠，42只，鼠齡3個月，體質(zhì)量250～280 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)公司提供，實驗動物合格證號：SCXK(京) 2016-0006，分籠飼養(yǎng)，維持室內(nèi)溫度18～25 ℃，濕度60%～70%，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，維持光暗12 h/12 h。

1.2 藥物及主要試劑

參照本課題組前期研究[3]結(jié)果，遠志湯中遠志、石菖蒲按照1∶1的比例配伍。參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)[4]，確定生藥產(chǎn)地、炮制方法，委托首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院制劑室進行加工，并對相對密度、pH值、衛(wèi)生學等進行檢測。4 ℃儲存?zhèn)溆?，保存時間不超過1周，用前搖勻。鹽酸多奈哌齊由中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司提供。羊抗鼠抗體IgG H&L (Alexa Fluor?488)及羊抗兔抗體IgG H&L (Alexa Fluor?594)購自英國Abcam公司。免疫熒光相關(guān)試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 慢性腦低灌注模型的制備

參考相關(guān)文獻[5]采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)制備慢性腦低灌注模型。大鼠術(shù)前適應環(huán)境1周，術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。0.4%(質(zhì)量分數(shù))的戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g i.p.)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸前皮膚去毛，碘伏消毒，頸前正中切開，鈍性分離皮下淺筋膜，沿氣管雙側(cè)仔細分離胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌，見動脈鞘；用玻璃分針分離暴露雙側(cè)頸總動脈并埋線，用絲線分別雙重結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈，并于兩結(jié)扎點之間剪斷血管，逐層縫合切口，消毒待醒。術(shù)中白熾燈照射保持大鼠肛溫在36.5～37.5 ℃。術(shù)后單籠放置，防止窒息。

1.4 實驗動物分組及給藥

采用數(shù)字表法將大鼠隨機分為：①對照組：3月齡正常大鼠；②模型組：慢性腦低灌注模型；③假手術(shù)組：分離暴露雙側(cè)頸總動脈，但不予結(jié)扎，不阻斷血流；④遠志湯高劑量組；⑤遠志湯中劑量組；⑥遠志湯低劑量組；⑦陽性藥物對照組(鹽酸多奈哌齊)。每組6只大鼠，其中，用藥各組分別于造模術(shù)后1周開始灌胃給藥，按 10 mL/kg灌胃，1次/d，給藥4周；對照組、模型組及假手術(shù)組同時給予同等劑量0.9%(質(zhì)量分數(shù))的氯化鈉注射液。

根據(jù)實驗動物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，成人與大鼠的折算系數(shù)為6.25，計算大鼠灌胃中藥的劑量，遠志湯高、中、低3 個劑量組，給藥劑量分別為20、10、5 g/(kg·d)，以恒溫水浴鍋分別濃縮成含生藥2.0、1.0、0.5 g/mL；鹽酸多奈哌齊0.52 mg/(kg·d)制成溶液。

1.5 Morris水迷宮測試

給藥結(jié)束后進行Morris 水迷宮行為測試。水迷宮由圓形水池和自動攝像及電腦分析系統(tǒng)組成。水池上方的攝像機同步記錄大鼠的運動軌跡。測試前將水注入池中，水深30 cm，水面高出站臺表面1 cm，放入奶粉使之成為乳白色，使大鼠不能見到站臺，水溫控制在22～25 ℃。實驗前1 d，將每只大鼠頭部染黑，每只動物第1天訓練2次使之學習并產(chǎn)生記憶，入池位置為站臺的對象限及鄰象限，于象限邊1/2弧度處將動物頭朝池壁入水，120 s未找到站臺者，將其引至站臺，放置30 s引導其學習與記憶，訓練期環(huán)境保持安靜與參照物不變。

定位航行實驗共進行5 d。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。實驗結(jié)束后記錄各動物的到達站臺的游動時間及距離、初始角度、搜索站臺的軌跡及逃避潛伏期，設定逃避潛伏期的時限為120 s。

定位航行實驗結(jié)束后將水下平臺撤除，在同一入水點將大鼠頭朝池壁放入水中，讓大鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺進行空間探索實驗 ，記錄大鼠在原平臺象限的活動時間。

1.6 腦組織取材及切片制作

各組大鼠在術(shù)后5周麻醉處死，0.4%(質(zhì)量分數(shù))戊巴比妥鈉(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后，沿肋弓剪開腹部皮膚、肌肉、腹膜，剪斷肋骨，剪開膈肌，小心勿刺中心臟，剪至第二肋骨，輕輕分離心臟與胸壁，用止血鉗翻開肋骨固定，再用鑷子分離心臟前筋膜，暴露主動脈弓；磨鈍針頭從心尖部刺入心臟后，進入主動脈后夾上止血鉗。灌注0.9%(質(zhì)量分數(shù))的氯化鈉注射液并同時剪開右心耳，灌注氯化鈉注射液約15 min，灌注量達200 mL，見右心耳流水變清亮、肝臟變蒼白色，隨后灌注4 ℃ 4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛(pH值為7.4)，400 mL，灌注時間30 min后，鼠前后肢、尾、頸僵硬，停止灌注。快速斷頭取腦，沿枕骨下剪斷鼠頭部，然后剪開頭皮、盡量分離，用剪刀剪開鼠枕骨，再用止血鉗撬開頭骨，完全暴露腦組織，用止血鉗插入顱底分離出腦組織，取出大腦置于4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛中后固定過夜，再于30%(質(zhì)量分數(shù))蔗糖中沉淀。24 h取出腦組織，參照大鼠圖譜，選取海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)和腦干等部位，滴取OCT冷凍切片包埋劑，固化后的組織從視交叉向后于恒低溫切片機-18 ℃連續(xù)冠狀切片，厚度8 μm，用賴氨酸處理好的玻片貼片，每張玻片貼3張切片。待貼好切片的玻片干燥后放于切片盒中，-20 ℃冰箱保存。

1.7 免疫熒光染色

切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化。微波照射進行抗原修復后，50%(體積分數(shù))乙醇[含3%(體積量分數(shù))H2O2]抑制非特異性過氧化物酶，99%(體積分數(shù))蟻酸處理5 min，20%(體積分數(shù))馬血清常溫封閉40 min，分別加入適量稀釋的一抗，Bcl-2、Bax和Caspase-3(均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜，陰性對照無一抗孵育，次日室溫孵育45 min，加入熒光標記二抗Alexa Fluor 488-羊抗鼠抗體(Bcl-2)或Alexa Fluor 594-羊抗兔抗體(Bax和Caspase-3)(均為1∶500)，室溫孵育1 h，使用50 mg/L DAPI 10 min復染核，緩沖甘油液封片，倒置相差熒光顯微鏡下拍照采集圖像，運用Image-Pro Plus 6.0將綠色/紅色熒光單色照片轉(zhuǎn)換為黑色圖片，選取圖片中黑色作為判斷陽性的統(tǒng)一標準，分析每張圖片得出平均積分吸光度。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 遠志湯對大鼠Morris水迷宮定位航行實驗的影響

雙因素重復測量的方差分析及其兩兩比較結(jié)果顯示，模型組大鼠較對照組和假手術(shù)組逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，搜索距離明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。遠志湯各劑量組大鼠逃避潛伏期和搜索距離均較模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中以高、中劑量組更為顯著，詳見表1、表2。

2.2 遠志湯對大鼠Morris水迷宮空間探索實驗的影響

與對照組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠在原平臺所在象限搜索時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。遠志湯各劑量組大鼠在原平臺所在象限搜索時間均較模型組顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見表3。

2.3 遠志湯對慢性腦低灌注大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

模型組大鼠海馬Bax和Caspase-3的表達較對照組和假手術(shù)組有顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Bcl-2的表達較對照組和假手術(shù)組則顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。使用遠志湯高、中劑量干預后Bax和Caspase-3的表達顯著減少(P<0.05)，而Bcl-2的表達顯著增加(P<0.05)，而遠志湯低劑量干預對Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較Tab. 1 Comparison of escape latency of Morris water maze experiment in each group

Analysis of variance analysis for two-factor repeated measures (corrected by Greenhouse-Geisser): day:F=47.544,P=0.000; day×group:F=0.703,P=0.681; group:F=52.140,P=0.000.△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group at the same time point;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group at the same time point.

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗搜索距離比較Tab.2 Comparison of search distance of Morris water maze experiment in each group

Analysis of variance analysis for two-factor repeated measures (corrected by Greenhouse-Geisser): day:F=51.261,P=0.000; day×group:F=0.855,P=0.713; group:F=78.276,P=0.000.△△P<0.01vscontrol group at the same time point;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group at the same time point.

表3 各組大鼠Morris水迷宮實驗原平臺象限活動時間比較Tab.3 Comparison of search time in the quadrant of the original platform in Morris water maze experiment in each group

表4 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax和Caspase-3含量比較Tab. 4 Level of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in hippocampus of each group

△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.Bcl-2: B-cell lymphoma-2;Bax: Bcl-2 associated X protein;Caspase-3: cysteinyl aspartate specific proteinase-3.

圖1 Bcl-2、Bax和Caspase-3在各組大鼠海馬組織中的表達Fig.1 Expression of Bcl-2, Bax and Caspase-3 in hippocampus of rats in each group

Representative photomicrographs of immunofluorescence staining with an anti-Bcl-2(A), anti-Bax(B), anti-Caspase-3(C) antibody in hippocampus of rats in each group.1: control group;2: model group;3: sham operation group;4: Yuanzhi decoction high dose group;5: Yuanzhi decoction medium dose group;6: Yuanzhi decoction low dose group;7: donepezil hydrochloride group；Bcl-2: B-cell lymphoma-2;Bax: Bcl-2 associated X protein;Caspase-3: cysteinyl aspartate specific proteinase-3.

3 討論

腦缺血尤其是老年人普遍存在的慢性腦低灌注與認知功能障礙的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的聯(lián)系[6]。中醫(yī)理論認為，老年人年老體衰，腎精不足，臟腑得不到正常濡養(yǎng)，以致氣血津液運行不暢，聚而生痰，痰濁日久，腦失所養(yǎng)，蒙蔽清竅，阻痹神明，表現(xiàn)為神情癡呆，語無倫次，遇事多忘等癥。如《石室秘錄·呆病》[7]云：“痰氣最盛，呆氣最深”，指出痰濁是本病的重要病機。本課題組從痰濁蒙蔽清竅入手，選用具有安神益智、開竅醒神功效的臨床常用對藥遠志和石菖蒲，二者配伍應用，名曰遠志湯。遠志湯出自《圣濟總錄》[8]，遠志性微溫、味苦辛，長于祛痰開竅、安神益智；石菖蒲性溫、味辛，善宣氣除痰、開竅醒神；二藥合用，相輔相成，使氣自順而壅自開，氣血不復上菀，痰濁消散，不蒙清竅，而神志自清。

前期研究[9]以遠志、石菖蒲為君藥研制了院內(nèi)制劑“腦康Ⅱ號”，臨床觀察發(fā)現(xiàn)腦康Ⅱ號能有效改善腦缺血致血管性認知障礙患者的學習、記憶功能。而應用中藥小復方遠志湯對慢性腦低灌注導致的認知功能障礙進行干預，既體現(xiàn)了中藥復方“多成分、多靶點”的優(yōu)勢，又便于深入分析藥物具體作用機制。實驗研究[10-11]表明，遠志湯的主要活性成分遠志皂苷元以及石菖蒲的主要活性成分β-細辛醚均可以降低細胞凋亡率，保護海馬神經(jīng)元，增強實驗動物的學習記憶能力等方面的作用[12-13]。

在慢性腦低灌注的情況下，腦組織血流降低和代謝異常，可導致腦關(guān)鍵部位(尤其是海馬區(qū))缺血、缺氧，誘發(fā)神經(jīng)元損害，從而影響大腦的認知功能，而細胞凋亡是引起海馬神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因之一[14]。凋亡使神經(jīng)元內(nèi)多種與凋亡有關(guān)的基因或蛋白酶激活，其中Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，而Bcl-2相關(guān)X蛋白抗體Bax屬于促凋亡蛋白。研究[15-16]表明，Bc1-2/Bax的比值決定著缺血、缺氧狀態(tài)下細胞的存亡，另外，Caspase家族是一類直接引起凋亡細胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，其活化是凋亡執(zhí)行階段的重要環(huán)節(jié)。該家族成員Caspase-3 是哺乳動物細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，處于凋亡級聯(lián)反應的核心位置[17]。

本研究對大鼠采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)造模，以模擬慢性腦低灌注的發(fā)生，在Morris水迷宮定位航行實驗中，模型組大鼠的逃避潛伏期和搜索距離較正常對照組明顯延長；在空間探索實驗中，模型組大鼠在原平臺所在象限搜索時間較正常對照組明顯縮短，說明模型組大鼠的空間學習記憶能力明顯受損，造模成功。而遠志湯可以明顯縮短大鼠的逃避潛伏期和搜索距離，并延長在原平臺所在象限搜索時間，表明遠志湯可以提高慢性腦低灌注大鼠的空間學習記憶能力。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，遠志湯可以降低大鼠海馬Bax和Caspase-3的表達，升高Bcl-2的表達，表明遠志湯對慢性腦低灌注大鼠空間學習記憶能力的影響可能與其對海馬凋亡相關(guān)蛋白表達的干預有關(guān)。中藥復方中各有效成分往往通過多種藥理途徑和藥效作用靶點，發(fā)揮防治疾病的作用[18-20]。因此，有必要開展進一步的研究，從不同角度深入分析遠志湯干預慢性腦低灌注導致認知功能障礙的作用機制。