林 群，劉付寶，余孝俊，謝 坤，趙義軍

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是原發(fā)性肝癌中的第二常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)差異比較大，其中東南亞最高，西方國(guó)家發(fā)病率偏低，并且逐年上升[1-2]。ICC發(fā)生可能是一個(gè)多因素過程，缺乏明確的風(fēng)險(xiǎn)因素，長(zhǎng)期存在的如肝內(nèi)膽管結(jié)石、肝膽吸蟲侵染、膽道囊腫、原發(fā)性硬化性膽管炎等被認(rèn)為是ICC的誘發(fā)因素[2]。由于其發(fā)病隱匿、淋巴轉(zhuǎn)移早、對(duì)放、化療不敏感、根治性手術(shù)切除率低等特點(diǎn)，大部分患者治療預(yù)后很差[3]。

X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白(zinc-finger protein X-linked，ZFX)是在哺乳動(dòng)物X染色體上編碼的轉(zhuǎn)錄因子。在細(xì)胞分化、胚胎及成人干細(xì)胞的自我更新中扮演著重要角色[4]。研究表明 ZFX不僅參與干細(xì)胞的自我更新，而且在結(jié)直腸癌[5]、肝細(xì)胞癌[6]、膽囊癌[7]、腎癌[8]等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，但ZFX在ICC中的表達(dá)及其臨床意義國(guó)內(nèi)外未見類似報(bào)道。該研究通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)ZFX蛋白在ICC組織中的表達(dá)水平，并和癌旁組織及肝內(nèi)膽管結(jié)石組織做比較，探討其與ICC患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科2012年2月～2017年2月行手術(shù)治療且臨床病歷資料完整的ICC患者的組織蠟塊，共選取60例ICC腫瘤組織、50例鄰近的癌旁正常膽管組織以及15例肝內(nèi)膽管結(jié)石的膽管組織標(biāo)本(經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)為無癌組織)。60例ICC患者均無全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療，其中男38例，女22例；年齡34～76(56.5±9.4)歲；血清糖鏈抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)≥37 ng/ml者34例，CA 19-9<37 ng/ml者26例；血清癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA) ≥5 ng/ml者20例，CEA<5 ng/ml者40例。TNM分期參考美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ+Ⅱ期45例，Ⅲ+Ⅳ期15例。腫瘤低分化者29例，中高分化者31例。根據(jù)術(shù)前檢查、術(shù)中所見及術(shù)后淋巴結(jié)病理檢查，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例。

1.2 主要試劑兔抗人ZFX多克隆抗體(bs-12306R，稀釋度1 ∶200)購(gòu)自北京博奧森生物公司；PV-9001檢測(cè)試劑盒(兔二步法檢測(cè)試劑盒)及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)ICC組織、癌旁組織及正常肝內(nèi)膽管結(jié)石組織中ZFX蛋白的表達(dá)。將病理科收集所得病例的石蠟包埋組織制作成厚度4 μm的切片。將所有的石蠟切片放入90 ℃的烤箱中烤片20 min，經(jīng)二甲苯溶液浸泡3次各10 min脫蠟，在依次不同濃度乙醇(100%、95%、75%)溶液各5 min，蒸餾水水化，適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，抗原修復(fù)采用檸檬酸微波高火加熱10 min，加熱后冷卻1 min，在加熱1 min，反復(fù)5次，然后室溫自然冷卻30 min，孵育一抗兔抗人ZFX抗體4 ℃過夜，PBS洗3次，滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物室溫20 min，PBS洗3次后DAB顯色，顯微鏡下控制，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，最后鏡檢采集數(shù)據(jù)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

圖1 膽管組織中ZFX的表達(dá) PV×200

1.4 結(jié)果判定染色結(jié)果評(píng)估由對(duì)臨床病理資料不知情的兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行。應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡在高倍鏡(×200)下隨機(jī)挑選5個(gè)視野，觀察陽性細(xì)胞染色程度和陽性細(xì)胞百分比，并進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分從0到3，依次為0(陰性，無色)，1(弱，淺黃色)，2(中，棕黃色)和3(強(qiáng)，棕褐色)； 陽性細(xì)胞百分比評(píng)分從0到4，依次為0(<5%)、1(≥5%～25%)、2(>25%～50%)、3(> 50%～75%)和4(>75%)。最終結(jié)果為兩項(xiàng)評(píng)分相加，總分≥ 3分認(rèn)為是高表達(dá)，<3分認(rèn)為是低表達(dá)[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，癌、癌旁及肝內(nèi)膽管結(jié)石組織的ZFX表達(dá)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier方法繪制ZFX高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存曲線，并用Cox回歸分析模型確定ICC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZFX蛋白在三種組織中的表達(dá)免疫組化染色(PV-9001兔二步法檢測(cè)試劑盒)檢測(cè)三種組織中ZFX的表達(dá)，鏡下觀察可見ZFX蛋白表達(dá)主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見表達(dá)，呈棕黃色染色顆粒，見圖1。結(jié)果表明ZFX蛋白在ICC組織、癌旁組織及肝內(nèi)膽管結(jié)石組織中高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.662，P<0.001)，且腫瘤組織中的高表達(dá)率明顯高于癌旁組織(χ2=13.914，P<0.001)和正常肝內(nèi)膽管結(jié)石組織(χ2=11.343，P=0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 ICC組織中ZFX蛋白表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系ICC組織中ZFX的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、血清CA19-9、有無脈管癌栓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在血清 CEA升高、腫瘤分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、 TNM分期高的患者ICC組織中ZFX高表達(dá)率較高，且在血清CEA、腫瘤分化程度的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 三種膽管組織中ZFX的表達(dá)[n(%)]

表2 ZFX表達(dá)與ICC患者臨床病理特征的關(guān)系分析[n(%)]

2.3 ZFX蛋白表達(dá)與ICC生存預(yù)后的關(guān)系將有完整隨訪資料的46例ICC患者分為高表達(dá)組(31例)和低表達(dá)組(15例)，總體隨訪時(shí)間2～40個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為12個(gè)月。結(jié)合免疫組化的結(jié)果，分析兩組總體生存率的差異，生存曲線見圖2，結(jié)果顯示ZFX高表達(dá)患者總體生存率明顯低于ZFX低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。單因素Kaplan-Meier總體生存率分析結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及ZFX表達(dá)與ICC患者預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)，多因素Cox回歸模型分析結(jié)果表明ZFX表達(dá)是ICC患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素(HR=2.635, 95%CI：1.044～6.651,P=0.040)，見表3。

圖2 ZFX高表達(dá)與低表達(dá)患者的生存曲線

因素HR95% CIP值單因素 年齡(≥60歲vs<60歲)1.0300.987～1.0740.173 性別(男vs女)1.1270.540～2.3530.750 腫瘤分化(中高分化vs低分化)1.1980.592～2.4240.616 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有vs無)2.7561.242～6.1150.013 TNM分期(Ⅰ/Ⅱ vs Ⅲ/Ⅳ)2.1491.025～4.5050.043 CA19-9(≥37 U/ml vs <37 U/ml)1.7410.816～3.7150.151 CEA(≥5 μl/L vs <5 μl/L)1.9130.925～3.9550.080 ZFX(高表達(dá)vs低表達(dá))3.1651.290～7.7650.012多因素 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有vs無)2.0450.425～9.8330.372 TNM分期(Ⅰ/Ⅱ vs Ⅲ/Ⅳ)1.0630.246～4.5870.934 CEA(≥5 μl/L vs <5 μl/L)1.4640.695～3.0860.316 ZFX(高表達(dá) vs 低表達(dá))2.6351.044～6.6510.040

3 討論

ZFX屬于鋅指蛋白家族，由X染色體編碼，全長(zhǎng)蛋白含有酸性轉(zhuǎn)錄激活域，核定位序列和由13 C2H2型鋅指組成的DNA結(jié)合域。研究[4,9]表明ZFX為胚胎干細(xì)胞和成人造血干細(xì)胞的共同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在胚胎和成人干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用。另外對(duì)于成人造血干細(xì)胞功能長(zhǎng)期穩(wěn)定的維護(hù)，一定功能水平的ZFX是必須的。許多研究[10]表明ZFX不僅參與干細(xì)胞的自我更新，而且與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，可以促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移，影響癌癥患者預(yù)后。Weng et al[7]研究表明在膽囊癌組織中經(jīng)常檢測(cè)到ZFX蛋白過表達(dá)，ZFX的表達(dá)與侵襲性臨床病理學(xué)顯著相關(guān)，并且導(dǎo)致膽囊癌患者的預(yù)后顯著較差，進(jìn)一步通過體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，敲低ZFX的表達(dá)能顯著抑制膽囊癌細(xì)胞侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移。Wu et al[11]研究證實(shí)了敲低ZFX基因的表達(dá)可通過下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶通路在體外和體內(nèi)抑制胃癌細(xì)胞增殖。

本研究通過免疫組化檢測(cè)60例ICC組織中ZFX的表達(dá)水平，結(jié)果顯示癌組織中ZFX表達(dá)明顯高于鄰近的癌旁組織(P<0.05)及肝內(nèi)膽管結(jié)石組織(P<0.05)，這表明ZFX可能在ICC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。然后繼續(xù)分析ZFX表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示在腫瘤組織分化低、TNM分期高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血清CEA升高的患者癌組織中ZFX高表達(dá)率較高。因此推測(cè)ZFX可能參與ICC的發(fā)生，過表達(dá)的ZFX可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這也為腫瘤分子靶向治療提供新的作用位點(diǎn)。

在隨訪資料中，對(duì)ZFX基因表達(dá)水平與ICC患者的臨床預(yù)后意義進(jìn)行研究，結(jié)果表明ZFX的表達(dá)與ICC生存預(yù)后顯著相關(guān)，高表達(dá)ZFX的ICC患者術(shù)后總體生存率較低。單因素生存分析結(jié)果表明有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM不同分期以及ZFX表達(dá)高與低的ICC患者其生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多因素Cox回歸模型分析結(jié)果表明ZFX可作為預(yù)測(cè)ICC患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素，這一結(jié)果與ZFX在其他腫瘤中的隨訪結(jié)果類似。Li et al[8]報(bào)道了53例腎癌的臨床隨訪研究，結(jié)果表明ZFX預(yù)測(cè)較差的預(yù)后，可作為預(yù)后指標(biāo)。Li et al[12]研究顯示ZFX可作為鼻咽癌患者的有效預(yù)后生物標(biāo)志物，而且還表明針對(duì)ZFX的靶向治療可能是預(yù)防鼻咽癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的新型治療策略。

綜上所述，ZFX在ICC中常常表現(xiàn)為高表達(dá)，ZFX的表達(dá)可能參與肝內(nèi)膽管的發(fā)生發(fā)展。高表達(dá)的ZFX與腫瘤惡性病理特征相關(guān)，是ICC不良預(yù)后的獨(dú)立因子。因此，ZFX可能成為ICC的潛在新型生物治療靶點(diǎn)，但具體的分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。