王同同，郜玉峰，曹雯君，葉 郡，鄒桂舟，李緒桐，孔雪杰

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球性的公共衛(wèi)生問題，可導(dǎo)致嚴(yán)重的感染后果，包括肝硬化和肝癌，DNA作為病毒復(fù)制最重要的指標(biāo)，可反映肝炎病毒的復(fù)制活性，能夠?qū)β訦BV感染患者進(jìn)行病情評(píng)估和療效監(jiān)測(cè)[1-2]。慢性乙型肝炎防治指南(2015版)指出慢性HBV感染治療目標(biāo)是最大限度長(zhǎng)期抑制 HBV復(fù)制，HBV DNA檢測(cè)不到[3]。但目前臨床上采用的傳統(tǒng)熒光定量PCR法，對(duì)于病毒載量≤500 IU/ml的標(biāo)本，無法準(zhǔn)確的反映病毒復(fù)制情況，允許病毒在低水平的復(fù)制，造成肝臟持續(xù)的炎癥損傷，肝功能的異常不能及時(shí)找出原因，給臨床工作帶來一定困擾，同時(shí)指南已指出對(duì)于HBV DNA的檢測(cè)建議采用靈敏度和精確度高的檢測(cè)方法。該文利用超敏HBV DNA的檢驗(yàn)技術(shù)試圖從病毒學(xué)的角度給出部分解釋；同時(shí)結(jié)合乙型肝炎病毒E抗原(hepatitis B e antigen，HbeAg)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)以及肝功能其他主要指標(biāo)進(jìn)一步探討超敏HBV DNA的臨床應(yīng)用價(jià)值[4-5]。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2017年1月～2018年1月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科370例傳統(tǒng)PCR法檢測(cè)HBV DNA陰性的門診患者，男女比例為4.67(182/39)，年齡19～74(44.36±12.12)歲，其中未治療的149例，治療組221例；治療組按照超敏結(jié)果分為超敏陰性組，超敏陽(yáng)性組；按照治療時(shí)間又分為治療半年、1年、2年、3年，分別為47例、63例、41例、56例。入組標(biāo)準(zhǔn)：① 診斷均符合中國(guó)慢性乙型肝炎防治指南(2015版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，既往有乙肝病史或HBsAg陽(yáng)性超過6個(gè)月；② 排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病、其他嗜肝病毒以及環(huán)境因素引起的肝功能異常；③ 排除合并其他系統(tǒng)疾病，如心血管疾病、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等；④ 排除梅毒、艾滋病等感染性疾病。所有入組的研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1HBV DNA兩種方法的血清水平檢測(cè) 收取患者空腹靜脈血標(biāo)本，3 500 r/min離心5 min，分離血清，-80 ℃低溫保存，避免反復(fù)凍融。超敏HBV DNA水平檢測(cè)采用德國(guó)進(jìn)口QlAsymphony磁珠吸附法全自動(dòng)核酸檢測(cè)儀及其配套試劑，正常范圍≤20 IU/ml；傳統(tǒng)HBV DNA檢測(cè)采用美國(guó)Agilent Mx3000P檢測(cè)儀，試劑盒為上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司的乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)，正常范圍≤500 IU/ml。

1.2.2其他臨床指標(biāo)檢測(cè) 乙肝五項(xiàng)定量采用雅培化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；肝功能采用美國(guó) Beckman 公司全自動(dòng)生化檢測(cè)儀及配套試劑分別檢測(cè)，其中包括ALT(正常范圍:9～50 U/L)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)(正常范圍:15～40 U/L)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)(正常范圍:35～135 U/L)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyltranspeptidase，GGT)(正常范圍:7～45 U/L)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)(正常范圍: 3.4～17.1 μmol/L)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)(正常范圍: 0.0～3.4 μmol/L)、白蛋白(albumin，ALB)(正常范圍:40～55 g/L)、球蛋白(globulin，GLB)(正常范圍: 20～40 g/L)。

2 結(jié)果

2.1 超敏HBV DNA與ALT、HbeAg相關(guān)性入組221例核酸初治且傳統(tǒng)法檢測(cè)HBV DNA陰性的乙肝病毒感染者作為研究對(duì)象，超敏陽(yáng)性率為44.34%；傳統(tǒng)檢測(cè)法(-)超敏檢測(cè)法(-)組123例，傳統(tǒng)檢測(cè)法(-)超敏檢測(cè)法(+)組98例，兩組中ALT異常率分別為23.58%(29/123)，35.71%(35/98)，χ2檢驗(yàn)兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.905,P=0.048)；AST異常率分別為26.82%(33/123)、28.57%(28/98)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.083，P=0.773)；HbeAg陽(yáng)性率分別為21.95%、45.91%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.264，P<0.05)。

2.2 肝功能中主要指標(biāo)在兩組中的統(tǒng)計(jì)描述兩組中肝功能主要指標(biāo)統(tǒng)計(jì)描述見圖1、表1。肝功能各指標(biāo)血清學(xué)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 超敏(-)組與超敏(+)組兩組中ALT、AST血清水平比較

2.3 治療時(shí)間與超敏HBV DNA和ALT之間的趨勢(shì)關(guān)系進(jìn)一步將所有患者按照治療時(shí)間長(zhǎng)短分為未治療、半年、1年、2年、3年，超敏HBV DNA陽(yáng)性率分別為74.49%、61.70%、52.38%、29.26%、33.93%，ALT異常率分別為41.61%、27.65%、34.92%、29.26%、26.78%。二者均采用Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)判斷與治療時(shí)間是否存在線性趨勢(shì)，檢驗(yàn)結(jié)果顯示超敏HBV DNA與治療時(shí)間存在明顯的負(fù)性相關(guān)(χ2=39.823,P<0.001),即患者治療時(shí)間越長(zhǎng)，超敏HBV DNA陽(yáng)性率降低，而ALT也有一定的趨勢(shì)關(guān)系(χ2=4.029,P=0.045)。另外結(jié)果顯示抗病毒治療半年、1年、2年，超敏HBV DNA陽(yáng)性率均大于50%。

表1 兩組中各肝功能指標(biāo)統(tǒng)計(jì)描述

2.4 傳統(tǒng)PCR法檢測(cè)HBV DNA陰性的CHB患者其ALT異常中超敏HBV DNA陽(yáng)性率ALT異常中超敏 HBV DNA陽(yáng)性率分別為77.41%、76.92%、59.09%、30.77%、31.25%。采用Fisher精確檢驗(yàn)(2×C)結(jié)果顯示，5組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.922，P=0.001)；兩兩比較采用Bonferroni法調(diào)整α水平，結(jié)果顯示未治療組與治療2年、3年差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，P=0.001)。

3 討論

HBV DNA定量檢測(cè)主要用于判斷患者體內(nèi)病毒的復(fù)制情況，指導(dǎo)治療方案的選擇和療效的判斷?，F(xiàn)臨床上應(yīng)用較多的是傳統(tǒng)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，采用熱裂解法人工進(jìn)行血清核酸提取純化，項(xiàng)目?jī)r(jià)格低，故臨床應(yīng)用較廣，但對(duì)于病毒載量≤500 IU/ml的患者無法精確定量分析，從而造成漏檢，而超敏HBV DNA檢測(cè)技術(shù)定量線性范圍寬，降低了漏檢率，采用磁珠吸附法全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行核酸提取純化，回收率高，重復(fù)性好，定量方法采用內(nèi)源性內(nèi)參，定量分析更加準(zhǔn)確，對(duì)于低病毒載量的患者更具優(yōu)勢(shì)[6-7]。

戎國(guó)棟 等[8]研究結(jié)果顯示超敏法陽(yáng)性檢出率高于傳統(tǒng)PCR法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究入組221例抗病毒治療且傳統(tǒng)法檢測(cè)HBV DNA陰性的乙肝病毒感染者，超敏陽(yáng)性率為44.34%，靈敏度相較于傳統(tǒng)法檢測(cè)的HBV DNA更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與上述報(bào)道觀點(diǎn)一致，同時(shí)研究結(jié)果也表明傳統(tǒng)法檢測(cè)HBV DNA陰性的患者，超敏HBV DNA可能為陽(yáng)性，而HBV DNA能直接反映患者體內(nèi)病毒量的多少，也是病毒復(fù)制活躍程度的直接指標(biāo)，因此不容忽視。

HbeAg是由HBV核心基因(前C區(qū))編碼的可溶性蛋白，是病毒復(fù)制、傳染的主要指標(biāo)，與血清HBV DNA水平變化有很好的一致性；ALT主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)中，是反映肝細(xì)胞早期損害極為敏感的指標(biāo)[9-10]。本研究按照超敏結(jié)果分為兩組，結(jié)果顯示超敏檢測(cè)組(+)中ALT異常率和HbeAg陽(yáng)性率較超敏檢測(cè)組(-)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與張玥 等[11]報(bào)道的結(jié)果一致。本研究?jī)山M中肝功能各指標(biāo)血清學(xué)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與石玉如 等[12]人的報(bào)道并不一致，考慮可能為超敏檢測(cè)法(+)組較報(bào)道中高濃度組HBV DNA水平低有關(guān)，但研究結(jié)果顯示超敏檢測(cè)組(+)中ALT、AST、ALP和ALB血清學(xué)水平均略高于超敏檢測(cè)組(-)。故超敏HBV DNA同時(shí)結(jié)合乙型肝炎五項(xiàng)與肝功能聯(lián)合診斷，能更好地了解病毒復(fù)制情況和肝細(xì)胞損害程度，為治療提供可靠的臨床依據(jù)[13]。

實(shí)際臨床工作中，部分抗病毒治療的慢性HBV感染患者HBV DNA≤500 IU/ml,但ALT和(或)AST顯示異常，排除其他原因?qū)е碌母喂δ墚惓?，病毒?dǎo)致肝臟炎癥性損傷仍是重點(diǎn)考慮因素。本研究結(jié)果顯示ALT異常中超敏DNA的陽(yáng)性率與抗病毒治療時(shí)間成反比，但在接受治療2年后陽(yáng)性率仍高達(dá)59.09%，說明病毒低水平復(fù)制造成肝臟持續(xù)炎癥反應(yīng)可能為ALT異常的主要原因。值得注意的是隨著治療時(shí)間的增加，ALT異常率并沒有明顯的下降趨勢(shì)，未治療、半年、1年的異常率分別為41.61%、27.65%、34.92%，目前暫考慮與入組樣本量少有關(guān)。另外，抗病毒治療2年、3年的超敏HBV DNA陽(yáng)性率分別為29.26%、33.93%，而ALT異?；颊咧谐鬑BV DNA陽(yáng)性率分別為30.77%、31.25%，二者都存在一定程度的升高，具有一致性，這表明患者對(duì)藥物的應(yīng)答率下降，超敏HBV DNA的定量檢測(cè)對(duì)藥效評(píng)估，耐藥預(yù)測(cè)有一定價(jià)值[14]。

綜上所述，超敏HBV DNA定量檢測(cè)對(duì)傳統(tǒng)法檢測(cè)HBV DNA陰性，尤其是肝功能異常的患者有較高的臨床監(jiān)測(cè)價(jià)值。有關(guān)超敏HBV DNA的定量結(jié)果與肝臟硬度測(cè)量值、乙肝五項(xiàng)定量結(jié)果等乙肝相關(guān)指標(biāo)需要進(jìn)一步探索分析。