王 晶，梅詠玉，丁少楨，袁靜靜，梅 俏，許建明

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種病因未明的腸道炎癥性疾病。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)是一類與炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與炎癥進(jìn)程的發(fā)生[1]。NF-κB是調(diào)節(jié)腸道炎癥應(yīng)答的關(guān)鍵靶點，維持腸上皮細(xì)胞功能和黏膜完整性[2]。研究[3]表明IBD患者腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)存在大量激活的NF-κB。IBD患者腸黏膜中白三烯E4(leukotriene E4, LTE4)和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)水平明顯升高[4-5]。LTE4和PGE2是經(jīng)典的炎癥介質(zhì)，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是一種含巰基氨基酸，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，引起細(xì)胞的氧化損傷。Hcy可引起NF-κB發(fā)生活化[6-7]。既往研究[8]表明，Hcy可損傷腸上皮細(xì)胞功能，引起腸黏膜通透性增加，加重腸道炎癥損傷，但Hcy引起腸上皮細(xì)胞損傷具體作用機制尚不明確。因此，該研究采用Hcy處理人結(jié)腸腺癌(human colon adenocarcinoma,Caco-2)細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性及LTE4和PGE2水平變化，探討Hcy是否通過活化NF-κB信號通路，促進(jìn)LTE4和PGE2的合成，導(dǎo)致腸黏膜炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材Caco-2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所，胎牛血清購自杭州四季青公司，TEMED(四甲基乙二胺)、Hcy和MTT均購自美國Sigma公司，乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制劑購自美國Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胞質(zhì)-核蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及非放射性試劑盒均購自美國Pierce公司，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，LTE4及PGE2ELISA試劑盒購自武漢新啟迪生物科技公司，Transwell小室購自美國Corning公司，細(xì)胞電阻儀購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 待Caco-2貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)皿底面積80%～90%時，棄上清液，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化；收集細(xì)胞混懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；在Transwell小室或培養(yǎng)板中重懸細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d更換培養(yǎng)基，待4～5 d后觀察Caco-2細(xì)胞生長情況。

1.2.2給藥方法 Hcy臨用前以生理鹽水溶解，調(diào)定pH至7.4，用DMEM完全培養(yǎng)基配制Hcy濃度。

表1 不同濃度Hcy作用不同時間對Caco-2細(xì)胞活性的影響

與對照組比較：*P<0.05

表2 不同濃度Hcy作用不同時間對Caco-2細(xì)胞LDH水平的影響

與對照組比較：*P<0.05

實驗分為對照組，不同濃度Hcy(10、20、50 μmol/L)處理組，藥物作用時間分別為1、3、6 h。

1.2.3Caco-2細(xì)胞生長檢測 將用不同濃度(10、20、50 μmol/L)Hcy處理的Caco-2細(xì)胞分別作用1、3、6 h后加入20 μl MTT，4 h后棄上清液，加入150 μl DMSO振蕩，根據(jù)MTT試劑盒說明方法，檢測490 nm處吸光度；將用不同濃度(10、20、50 μmol/L)Hcy處理的Caco-2細(xì)胞分別作用1、3、6 h后收集培養(yǎng)液，根據(jù)LDH試劑盒說明書方法，檢測450 nm處吸光度。

1.2.4Caco-2細(xì)胞通透性檢測 采用跨膜電阻(transepithelial electrical resistance, TEER)和熒光素-5-異硫氰酸酯(fluorescein-5-isothiocyanate, FITC)跨膜轉(zhuǎn)運量來檢測；按實驗分組將用Hcy處理的Caco-2細(xì)胞分別作用1、3、6 h后，TEER按照細(xì)胞電阻儀說明書進(jìn)行操作；實驗開始后，每隔30 min記錄一次TEER，并取樣于8 ℃冰箱保存，直至6 h結(jié)束，采用熒光分光光度計檢測425 nm處樣品中FITC的熒光值，計算FITC跨膜轉(zhuǎn)運量。

1.2.5Caco-2細(xì)胞NF-κB活性檢測 細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%時，使用1 ml胰酶消化，以每孔5×105個細(xì)胞密度接種，加入1 ml細(xì)胞懸液于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁后進(jìn)入實驗分組。設(shè)對照組，實驗組分別為10、20、50 μmol/L Hcy處理組，Hcy處理1、3、6 h后提取細(xì)胞核蛋白；根據(jù)BCA試劑盒說明方法檢測核蛋白濃度；非放射性試劑盒進(jìn)行電泳遷移率改變實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。

1.2.6Caco-2細(xì)胞上清液LTE4和PGE2的測定 實驗設(shè)對照組，實驗組分別為10、20、50 μmol/L Hcy處理組，Hcy處理1、3、6 h后收集細(xì)胞上清液，按照LTE4和PGE2試劑盒操作說明測定兩者濃度。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對Caco-2細(xì)胞生長的影響與對照組比較，Hcy處理組Caco-2細(xì)胞MTT吸光度明顯下降(P<0.05)，見表1，LDH吸光度明顯增加(P<0.05)，見表2，均具有濃度依賴性。不同濃度(10、20、50 μmol/L)Hcy對Caco-2生長均具有一定程度的抑制作用，且抑制程度與濃度和作用時間呈正相關(guān)性。

2.2 不同濃度Hcy對Caco-2細(xì)胞通透性的影響與對照組比較，隨著Hcy濃度的增加，F(xiàn)ITC的滲透量明顯增加(P<0.05)，見圖1；TEER的值明顯降低(P<0.05)，見圖2。不同濃度(10、20、50 μmol/L)Hcy均能影響Caco-2細(xì)胞通透性。

圖1 不同濃度Hcy作用Caco-2細(xì)胞FITC滲透量的變化

圖2 不同濃度Hcy作用Caco-2細(xì)胞TEER的變化

2.3 50 μmol/L Hcy對Caco-2細(xì)胞NF-κB活性的影響與對照組比較，Hcy組細(xì)胞NF-κB的DNA結(jié)合活性升高(P<0.05)；隨作用時間的延長，細(xì)胞NF-κB的DNA結(jié)合活性升高(P<0.05)，見圖3。

圖3 Hcy處理Caco-2細(xì)胞不同時間NF-κB活性改變

2.4 不同濃度Hcy對Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生LTE4及PGE2水平的影響與對照組比較，Hcy處理組LTE4和PGE2水平升高，不同濃度組間比較顯示，隨著Hcy濃度的升高，LTE4和PGE2水平隨之升高，見表3。

2.5 Hcy作用不同時間對Caco-2細(xì)胞合成LTE4及PGE2水平的影響50 μmol/L Hcy促進(jìn)Caco-2細(xì)胞合成LTE4和PGE2,且在0～6 h內(nèi)呈一定的時間依賴性(P<0.05)，見表4。

表3 不同濃度Hcy對Caco-2細(xì)胞合成LTE4及PGE2水平的影響

與對照組比較：*P<0.05；與10 μmol/L Hcy比較：#P<0.05；與20 μmol/L Hcy比較：△P<0.05

3 討論

IBD存在腸上皮損傷伴上皮屏障功能失調(diào)[9]。NF-κB是真核細(xì)胞的一種核轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，NF-κB二聚體因與其抑制性亞單位(IκB)結(jié)合，以無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)被炎癥介質(zhì)及內(nèi)毒素等刺激后，IκB經(jīng)過化學(xué)修飾作用被蛋白酶水解，NF-κB與IκB解離移至細(xì)胞核，與炎癥相關(guān)物質(zhì)DNA特定的κB序列結(jié)合，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB信號通路是腸道炎癥的重要調(diào)節(jié)機制，參與維持腸上皮屏障功能的完整性[2]。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是NF-κB重要的作用靶點。當(dāng)NF-κB受刺激被激活后，促進(jìn)5-LOX和COX-2過表達(dá)，使LTE4和PGE2生成增加，引起炎性活動持續(xù)發(fā)生[10]。IBD是腸道的一種慢性炎癥病變。既往研究[4-5]表明，IBD患者尿液中LTE4和PGE2水平較正常對照組明顯升高，一定程度上LTE4可反映腸道炎癥程度，PGE2升高程度反映疾病活動度。LTE4和PGE2與炎癥關(guān)系密切，促進(jìn)炎癥進(jìn)程的發(fā)展。LTE4能引起腸黏膜血管通透性和腸黏液分泌增加，促進(jìn)腸道炎癥的級聯(lián)放大[11]。PGE2在腸道炎癥時，影響腸黏膜血液循環(huán)，增加腸黏膜通透性，降低腸黏膜吸收，導(dǎo)致血便和腹瀉的發(fā)生[5]。

表4 Hcy作用不同時間對Caco-2細(xì)胞合成LTE4和PGE2水平的影響

與對照組比較：*P<0.05

Hcy參與蛋氨酸代謝過程，可引起NF-κB活性增強，促進(jìn)氧化損傷，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障，引起炎癥介質(zhì)釋放增加，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展[7,12]。此外，Hcy可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生白介素-6(interleukin-6, IL-6)[13]和 IL-8等[14]炎性因子對宿主起免疫監(jiān)視作用。Lazzerini et al[15]發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)中，Hcy通過激活NF-κB，刺激IL-6和IL-8合成，參與RA免疫炎癥損傷。朱建華等[6]發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化中，Hcy激活NF-κB促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞IL-6合成增加。本研究表明Hcy作用于Caco-2細(xì)胞，激活NF-κB，Caco-2細(xì)胞中FITC增加和細(xì)胞的TEER降低，且呈一定的濃度依賴性，提示Hcy可通過活化NF-κB信號通路，引起Caco-2細(xì)胞黏膜屏障功能受損，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加。同時，本研究結(jié)果顯示Hcy作用于Caco-2細(xì)胞激活NF-κB，引起LTE4和PGE2合成增加，與課題組前期動物實驗結(jié)果一致，提示Hcy通過促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放調(diào)節(jié)腸道炎癥過程。

綜上所述，Hcy可通過活化NF-κB信號通路，引起Caco-2細(xì)胞黏膜通透性增加，促進(jìn)炎癥介質(zhì)LTE4和PGE2的合成，加重腸黏膜功能損傷，為Hcy在IBD病理生理機制中的作用提供實驗依據(jù)。同時也為尋找Hcy拮抗劑為臨床IBD的診療提供新思路。但NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是否受其上游其他信號通路調(diào)控，有待進(jìn)一步深入研究。