雍 軍，哈再古麗·賈漢，李林格，張 華，馮 娟，趙 琦，尼力帕爾·阿力木

鼻息肉(nasal polyps，NP)是在鼻腔中形成的一種良性腫物，盡管不是致命性疾病，可是發(fā)病率極高，表現(xiàn)出的癥狀為頭痛、鼻塞等，能夠?qū)颊叩纳钆c工作造成嚴(yán)重困擾[1-2]。這幾年，研究[3]顯示，鼻息肉是不同細(xì)胞因子共同參與、具有延續(xù)性的炎癥反應(yīng)產(chǎn)物，通過(guò)在患者鼻腔內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素，能夠減少分泌的炎性細(xì)胞因子；其中鼻息肉上皮細(xì)胞不斷增殖，對(duì)組織損傷進(jìn)行修復(fù)，確保上皮細(xì)胞保持完整的屏障結(jié)構(gòu)，并且讓鼻息肉組織的環(huán)境保持穩(wěn)態(tài)[4-5]。微小RNA(microRNA，miR)作為一類新型基因調(diào)控分子，與鼻息肉的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。微小RNA(miR)-200 家族包括5個(gè)成員，即miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c以及miR-429，其中，miR-200a在1號(hào)染色體，當(dāng)miR-200a過(guò)度表達(dá)會(huì)讓惡性腫瘤細(xì)胞得到侵襲能力，然而miR-200a在鼻息肉中的功能和作用機(jī)制不是很確定[6-8]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是在牛垂體形狀細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)分離并純化的糖蛋白，能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞具有的分裂增生能力，還可以提升毛細(xì)血管通透性[9]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α在腫瘤細(xì)胞中可獲得大量表達(dá)，可以激活PI3K/AKT/FRAP途徑，從而調(diào)整細(xì)胞增殖與凋亡[10]。該研究采取多種分子生物學(xué)方法，探討了miR-200a通過(guò)調(diào)控HIF-1α與VEGF通路調(diào)節(jié)鼻息肉上皮細(xì)胞的增殖及凋亡作用，從而揭示miR-200a在鼻息肉中的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑通過(guò)倫理審核，取人體鼻息肉上皮CNE細(xì)胞經(jīng)倫理審核備案，鼻息肉上皮CNE細(xì)胞來(lái)源于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科鼻息肉手術(shù)患者，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2的孵箱；miR-200a模擬物和對(duì)照模擬物購(gòu)自美國(guó)Ambion 公司；ECL系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Syngene公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人HIF-1α、VEGF單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CNE細(xì)胞分為3組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將CNE細(xì)胞瞬間轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物、對(duì)照模擬物，空白組不轉(zhuǎn)染任何試劑，采用PCR檢測(cè)儀驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染的效率。把已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株分別接種在密度為5 000個(gè)/孔的真空培養(yǎng)板，經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)，使用MTT試劑盒對(duì)細(xì)胞的增殖性進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)接種至3個(gè)孔。

1.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)使用Tunel試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，這是原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)，可以利用DAB顯色來(lái)表達(dá)凋亡細(xì)胞，并結(jié)合光學(xué)顯微鏡來(lái)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。CNE細(xì)胞經(jīng)過(guò)96孔48 h培養(yǎng)，吸取培養(yǎng)液，以4 ℃、1 000 r/min離心10 min，將沉淀取出，添加PBS重懸，再離心后提取，加入300 μl凋亡檢測(cè)緩沖液，以單個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行測(cè)算，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)接種至3個(gè)孔。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)在miR-200a轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度，接著分離蛋白，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉并添加一抗β-actin、HIF-1α、VEGF，4 ℃過(guò)夜。通過(guò)TBST對(duì)膜進(jìn)行30 min清洗，添加二抗在室溫下孵育1 h，再次用TBST洗膜30 min，添加ECL發(fā)光劑，最后使用電腦對(duì)發(fā)光進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 3組轉(zhuǎn)染效果、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況比較qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-200a轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及空白組比較，miR-200a的表達(dá)水平升高37.82倍，表明miRNAs mimics轉(zhuǎn)染成功；轉(zhuǎn)染48 h，實(shí)驗(yàn)組的活細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組與空白組，細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組與空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 HIF-1α與VEGF表達(dá)對(duì)比轉(zhuǎn)染48 h后Western blot檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組的HIF-1α與VEGF表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組與空白組(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2和表2。

圖1 HIF-1α蛋白的表達(dá)情況對(duì)比1：實(shí)驗(yàn)組；2：對(duì)照組；3：空白組

圖2 VEGF蛋白的表達(dá)情況對(duì)比1：實(shí)驗(yàn)組；2：對(duì)照組；3：空白組

3 討論

在臨床上，鼻息肉是發(fā)病率極高的炎性疾病，屬于非瘤樣腫物，一般是從篩骨脫落進(jìn)入鼻腔，進(jìn)而阻塞鼻腔，以及副鼻竇出現(xiàn)引流障礙[11]。其病理特征是水腫基質(zhì)中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，絕大多數(shù)鼻息肉主要為嗜酸性粒細(xì)胞，當(dāng)前發(fā)病機(jī)制尚不確定，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)同多因素發(fā)病這一觀點(diǎn)[12]。研究者總結(jié)出鼻息肉的主要形成過(guò)程：受各因素影響，鼻黏膜上皮發(fā)生斷裂，使得纖維組織脫離；脫離的纖維組織出現(xiàn)表面皮化，進(jìn)而形成小息肉；隨后小息肉形成了中腺體；息肉進(jìn)一步增生以及增長(zhǎng)，最后完全形成息肉。在鼻息肉形成及發(fā)展方面，上皮細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)持續(xù)增殖，從而修復(fù)組織損傷，使上皮細(xì)胞的屏障結(jié)構(gòu)保持完整，并且讓鼻息肉組織的環(huán)境保持穩(wěn)態(tài)。而且，上皮細(xì)胞效應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展，還會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)功能具有免疫作用，這種免疫作用跟炎癥的刺激時(shí)間存在一定關(guān)聯(lián)[13]。

表1 3組轉(zhuǎn)染效果、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況比較

與空白組比較：*P<0.05；與對(duì)照組比較：#P<0.05

表2 3組HIF-1α與VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比

與空白組比較：*P<0.05；與對(duì)照組比較：#P<0.05

microRNA是內(nèi)源基因編碼的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，通過(guò)跟靶mRNA的3′-UTR、編碼區(qū)部分配對(duì)或完全配對(duì)，對(duì)蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)行抑制，或使mRNA降解，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄，負(fù)向調(diào)控的靶基因表達(dá)?，F(xiàn)代研究[14]表明miRNA與疾病發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，特異的miRNA表達(dá)譜可作為疾病預(yù)防和診斷的標(biāo)志物。miR-200家族在上皮細(xì)胞的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，miR-200家族成員可以抑制上皮細(xì)胞形成過(guò)程，可抑制E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)。本研究顯示，在轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組的活細(xì)胞顯著低于對(duì)照組與空白組；細(xì)胞凋亡率方面，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以及空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這說(shuō)明miR-200a的表達(dá)水平與鼻息肉細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)性，與凋亡能力呈正相關(guān)性，表明miR-200a可能參與鼻息肉細(xì)胞的調(diào)控。

在鼻息肉組織當(dāng)中，上皮基底細(xì)胞存在多向分化的潛能，屬于多能干細(xì)胞。Fas-L在鼻息肉上皮基底細(xì)胞中表現(xiàn)為過(guò)度表達(dá)，而鼻息肉組織當(dāng)中，淋巴細(xì)胞主要為T細(xì)胞[15]。HIF-1由α亞單位和β亞單位組成，α亞單位受氧調(diào)控，具有特異性，對(duì)HIF-1活性有著決定性作用。當(dāng)癌基因激活時(shí)或抑癌基因失活時(shí)，腫瘤細(xì)胞中的HIF-1α活性就會(huì)升高。并且PI3K/AKT可因PTEN的負(fù)調(diào)控作用喪失而呈現(xiàn)高活化狀態(tài)，從而誘導(dǎo)HIF-1表達(dá)上調(diào)[16]。VEGF是一種同型二聚體糖蛋白，廣泛分布于人的腦、眼、血漿、腹腔、腎、脾、肝、肺等組織中，對(duì)維持血管的正常形態(tài)和功能有積極作用。VEGF與受體結(jié)合能夠?qū)?nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖起到誘導(dǎo)作用，有利于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，促使新生血管產(chǎn)生[17]。本研究中，轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α和VEGF表達(dá)水平比對(duì)照組和空白組明顯降低(P<0.05)。表明miR-200a有可能在HIF-1α/VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用，進(jìn)而對(duì)鼻息肉的凋亡和增殖產(chǎn)生影響。下一步需通過(guò)驗(yàn)證miR-200a下游靶基因，繼續(xù)闡明miR-200a參與鼻息肉細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療手段和方法提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，miR-200a可通過(guò)激活HIF-1α與VEGF通路，對(duì)鼻息肉上皮細(xì)胞的增殖能力加以限制，使凋亡能力得到提升，進(jìn)而影響鼻息肉細(xì)胞生物行為。