王定榮，王亞亭，華 山，范曉云

支氣管哮喘簡稱哮喘，是一種由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是呼吸系統(tǒng)常見疾病之一[1]。然而，當前哮喘的傳統(tǒng)治療藥物仍不能有效控制重度哮喘患者癥狀，因此，尋找哮喘治療的新靶點和治療藥物，成為臨床哮喘治療的新策略[2-3]。

五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)具有上調細胞抗氧化能力[4-5]，保護心肌細胞，保肝、抗炎以及抗腫瘤等藥理作用[6-7]。在應激狀態(tài)下，高遷移率族蛋白(high mobility group box-1 protein, HMGB1) 可通過Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)激活先天免疫反應[8]。依賴性HMGB1轉導途徑最終活化核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，引起炎癥因子的釋放，在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[9-10]。該實驗探討了HMGB1/TLR4/ NF-κB信號通路其相關蛋白在支氣管哮喘小鼠變應性氣道炎癥中的表達變化，進一步闡明哮喘的發(fā)病機制，為Sch B的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑Sch B購自中國食品藥品檢定研究院；地塞米松(dexamethasone,Dex)購自美國Sigma公司；白細胞介素(interleukin，IL)-1β 、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α酶聯(lián)免疫試劑盒購自南京凱基生物科技有限責任公司； HMGB1、TLR4、NF-κB p65和磷酸化核因子(p-NF-κB p65)抗體購自英國Abcam公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，胞質胞核分離試劑盒購自英文特生物技術(北京)有限公司。

1.2 動物雌性BALB/c小鼠，60只，18～22 g，SPF級，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證編號：2008001672875。所有動物于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫(22±1) ℃，空氣濕度40%～50%，晝夜交替時間12 h條件下普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 實驗過程BALB/c小鼠隨機分為5組，每組12只：空白對照組(Ctrl)、模型組(Model)、地塞米松組(Dex 2 mg/kg)、Sch B低劑量(Sch B 20 mg/kg)組、Sch B高劑量(Sch B 40 mg/kg)組。除Ctrl組外，其他各組小鼠于第1、8天腹腔、皮下分別注射0.1 ml致敏液，0.2 ml致敏液含卵蛋白(ovalbumin, OVA)0.1 ml，氫氧化鋁0.02 mg，第15～28天再給予5%的OVA霧化，每次20 min。Ctrl組以等體積生理鹽水代替致敏液，并用生理鹽水霧化。Dex 2 mg/kg組、Sch B 20 mg/kg組和Sch B 40 mg/kg組分別于每次霧化前30 min給予2 mg/kg的Dex、20 mg/kg和40 mg/kg的Sch B灌胃，Ctrl組和Model組給予等體積生理鹽水。

1.4 血液細胞學檢查動物在最后一次激發(fā)24 h后，眼眶取血20 μl置于0.38 ml嗜酸粒細胞(eosinophil, EOS)計數(shù)液中混勻，光學顯微鏡下進行嗜酸粒細胞計數(shù)。

1.5 血清中SOD、MDA含量測定小鼠眼眶取血，4 500 r/min離心15 min后取上清液于-80 ℃凍存待測。按照試劑盒的說明書測定SOD、MDA的含量。

1.6 血清和肺組織中炎癥因子的測定肺組織于預冷生理鹽水中勻漿后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后取上清液于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。依照ELISA試劑盒說明書操作方法檢測血清和肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.7 組織病理學檢查小鼠眼眶取血后處死，將左側肺組織于10%的中性福爾馬林溶液中固定24 h，隨后包埋于石蠟并切成4 mm厚的切片進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)用于觀察肺組織病理學改變情況。

1.8 Western blot分析將凍存的肺組織分成兩份，一份按照胞質胞核分離試劑盒說明書操作，用于NF-κB的蛋白提??；一份常規(guī)提取蛋白，用于HMGB1和TLR4的蛋白提取，即在加入預冷的蛋白裂解液及PMSF勻漿后，12 000 r/min離心12 min后收集上清液。BCA試劑盒測定蛋白濃度后，蛋白樣品置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后將其轉移到PVDF膜上。轉膜完畢后，TBST洗3次； 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉結束后將PVDF膜分別浸入一抗中，于4 ℃ 孵育過夜。第2天棄一抗，加入二抗于搖床室溫孵育2 h。二抗孵育結束后，棄抗體，取出PVDF膜用TBST清洗3次。使用天能曝光儀曝光，凝膠分析軟件Quantity one(美國Bio-Rad公司)測定主帶的光密度值用于計算相關蛋白表達水平。

2 結果

2.1 Sch B對哮喘小鼠血液EOS數(shù)的影響與Ctrl組相比，Model組小鼠血液中EOS顯著升高(P<0.01)。與Model組相比，Sch B 20 mg/kg組(F=3.05，P<0.05)和Sch B 40 mg/kg組(F=7.22,P<0.01)能顯著降低EOS含量。見圖1。

圖1 Sch B對哮喘小鼠血液EOS數(shù)的影響

2.2 Sch B對哮喘小鼠血清中SOD和MDA含量的影響與Ctrl組相比，Model組小鼠血清中SOD活性顯著降低(P<0.01)。與Model組比較，Dex 2 mg/kg組、Sch B(40 mg/kg)治療組小鼠血清中SOD活性明顯升高(P<0.01)。與Ctrl組比較，Model組小鼠血清中MDA水平顯著升高，而與Model組相比，Dex 2 mg/kg組、Sch B(20、40 mg/kg)治療組小鼠血清中MDA水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖2。說明Sch B可能通過抗氧化作用對哮喘小鼠肺組織具有一定的保護作用。

圖2 Sch B對哮喘小鼠血清中SOD、 MDA含量的影響

與Ctrl組比較：**P<0.01；與Model組比較：##P<0.01

2.3 Sch B對哮喘小鼠血清和肺組織中炎性細胞因子表達的影響與Ctrl組相比，Model組小鼠血清(圖3A)和肺組織(圖3B)中IL-1β、 IL-6和TNF-α等炎性細胞因子含量顯著增加(P<0.01)。與Model組比較，Dex 2 mg/kg組、Sch B(20、40 mg/kg)治療組的小鼠血清和肺組織中IL-1β、IL-6和 TNF-α等炎性細胞因子含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。 見圖3。表明Sch B可以通過減少炎癥因子的表達緩解哮喘小鼠變應性氣道炎癥的癥狀。說明Sch B可能通過抑制炎癥反應對哮喘小鼠肺組織具有一定的保護作用。

2.4 Sch B對哮喘小鼠肺組織病理的影響Ctrl組小鼠肺泡組織形態(tài)均勻，無炎癥細胞浸潤。Model組小鼠肺組織周圍可見中度炎細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞為主，同時肺壁增厚，說明模型復制成功。與Model組比較，Dex 2 mg/kg組、Sch B(20、40 mg/kg)治療組病變都有不同程度的減輕。見圖4。說明Sch B對哮喘小鼠肺損傷具有一定的保護作用。

2.5 Sch B對哮喘小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達的影響與Ctrl組比較，Model組小鼠HMGB1、TLR4、p-NF-κB蛋白水平顯著上升(P<0.01)，與Model組比較，Sch B和陽性藥Dex均能下調這些蛋白的表達(P<0.05,P<0.01)。見圖5。說明Sch B可通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路改善哮喘小鼠肺部炎癥。

3 討論

哮喘是一種容易復發(fā)的慢性呼吸道疾病，其病因十分繁多、發(fā)病機制復雜但其本質是氣道慢性炎癥。多項臨床研究[11]證明糖皮質激素在哮喘治療中是最有效的抗炎藥物，其抗炎作用機制是由氣道細胞質內的糖皮質激素受體所介導主要通過抑制細胞因子產生，減少T淋巴細胞活化，從而減輕氣道炎癥反應，但仍不能全面改善哮喘患者的癥狀。有大量研究[5-7]表明，Sch B有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學活性，本實驗旨在探究Sch B對哮喘是否有治療效果。

圖3 Sch B對哮喘小鼠血清(A)和肺組織(B)中炎性細胞因子表達的影響

圖4 Sch B對哮喘小鼠肺組織病理的影響HE×200

A：Ctrl組；B：Model組；C：Dex 2 mg/kg組；D：Sch B 20 mg/kg組；E：Sch B 40 mg/kg組;黑色箭頭：炎性浸潤，主要為中性粒細胞；紅色箭頭：肺壁增厚明顯

圖5 Sch B對哮喘小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達的影響

本實驗選用卵蛋白(OVA)配合免疫佐劑氫氧化鋁構建哮喘模型，該模型是一個十分經典的動物模型，能有效模擬人在哮喘疾病狀態(tài)下的病理變化，是比較理想的動物模型[12]。肺組織HE染色結果顯示，哮喘組小鼠氣道和血管周圍產生大量炎性細胞浸潤，以EOS、中性粒細胞和淋巴細胞為主，肺間質有明顯的EOS和淋巴細胞浸潤，支氣管管壁增厚，支氣管上皮細胞脫落。另外，哮喘組小鼠血液中的EOS數(shù)量顯著上升，SOD活力明顯降低，MDA含量顯著升高，同時血清和肺組織中炎性細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表達也顯著升高。說明本實驗成功建立哮喘小鼠模型。與Model組比較，Dex 2 mg/kg組、Sch B(20、40 mg/kg)治療組的炎癥反應都有不同程度的減輕，說明Sch B對哮喘有一定的治療作用，其中Sch B高劑量組治療效果與Dex 2 mg/kg組相差不大，且優(yōu)于低劑量組。為了進一步探究Sch B對哮喘的作用機制，本實驗采用Western blot方法來檢查小鼠肺組織中HMGB1、TLR4和NF-κB的表達情況。作為哮喘發(fā)作時一個重要信號因子，近期大量研究[13]表明NF-κB參與哮喘的炎癥反應、氣道重塑、細胞凋亡和增生等過程。在靜息狀態(tài)下，NF-κB存在細胞質中，許多炎癥的刺激導致NF-κB的激活，誘導各種生長因子、細胞因子、趨化因子和轉錄因子的表達，在機體炎癥反應、免疫應答、細胞生長發(fā)育、細胞凋亡等方面起著重要作用，進一步參與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展。HMGB1最初發(fā)現(xiàn)時是一種在真核細胞內結構性表達的多功能蛋白，主要存在于細胞核內，而當細胞被激活后，它能促使細胞發(fā)生多種復制的信號反應。研究[14-15]表明，HMGB1可作為TLR4的內源性配體，增強NF-κB 的活性，從而產生大量的細胞因子。Western blot結果顯示，與Model組相比，低、高Sch B劑量組、Dex 2 mg/kg組均能明顯降低肺組織中HMGB1、TLR4和p-NF-κB水平。這提示Sch B可能通過調節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路來達到改善哮喘的治療效果。