黃軍祥 ，胡詠梅，石 海，徐雄飛，周春立

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范圍內(nèi)第五大惡性腫瘤，也是全球由癌癥引起病患死亡的三大惡性腫瘤之一[1]，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)報道，接受常規(guī)化療藥物的轉(zhuǎn)移性GC患者的總生存率(overall survival rate，OS)在5年內(nèi)不到10%[2]；而以曲妥珠單抗為代表的生物療法被引入治療GC，結(jié)果顯示在人類表皮受體2(HER-2)GC腫瘤患者中無進展生存期且OS方面均無明顯優(yōu)勢[3]。因此，針對GC尋找較為理想的治療方法具有重要意義。而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前針對GC治療的較為理想的方法之一，前期研究[4]表明CsA可顯著誘導(dǎo)人胃癌BGC823細(xì)胞凋亡，其機制可能與細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量產(chǎn)生和線粒體膜電位的下降(△Ψm)有關(guān)。有研究[5]顯示線粒體在參與細(xì)胞凋亡和炎癥過程中發(fā)揮積極作用，強調(diào)靶向線粒體功能在改善癌癥治療方面有巨大的潛力。該實驗利用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測環(huán)孢素A(cyclosporin A,CsA)處理后MGC80-3細(xì)胞凋亡率，電鏡觀察細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C(cytochrome C)蛋白的表達(dá)，進一步探討CsA誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡的相關(guān)機制，為臨床針對GC治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人胃癌MGC80-3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞生長條件：含10%胎牛血清和12 U/ml慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中、37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)換液傳代培養(yǎng)，實驗采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.1.2藥品、試劑和儀器 CsA標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉(中國藥品生物制品檢定所，批號130495-200202,純度98.8%)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；一抗(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；內(nèi)參GAPDH(上海康城生物制品有限公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；0.22 μm微孔濾膜(美國Pall公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司)；透射電子顯微鏡(日本日立公司)；其他實驗所需試劑(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1FCM檢測細(xì)胞凋亡率 選對數(shù)生長期MGC80-3細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，設(shè)對照組，實驗組采用濃度為5、10、20 μmol/L的CsA作用細(xì)胞48 h，經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，濃度調(diào)整至5×106/ml～1×107/ml，冰PBS洗滌2次，離心后加入400 μl緩沖液重懸細(xì)胞。在4 ℃條件下，加入5 μl AnnexinV-FITC試劑混勻后，放置于培養(yǎng)箱中避光孵育15 min，再加PI 10 μl避光染色5 min，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.2.2電鏡觀察MGC80-3細(xì)胞凋亡形態(tài) 方法同上，CsA作用MGC80-3細(xì)胞48 h后，胰酶消化收集各組約5×106個細(xì)胞，吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入4 ℃預(yù)冷PBS輕輕吹打均勻，1 000 r/min、4 ℃離心15～20 min，輕輕吸棄上清液。吸管沿管壁緩慢加入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液2 ml，4 ℃固定24 h。室溫下丙酮脫水處理，包埋、修塊、制備半薄切片，定位后制備超薄切片，經(jīng)枸椽酸鉛染色，Hitachi-600型透射電鏡觀察和攝片。

1.2.3Western blot檢測細(xì)胞蛋白的表達(dá) 設(shè)對照組，實驗組CsA濃度分別為5、10、20 μmol/L，按上述濃度分別處理MGC80-3細(xì)胞48 h后用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒行細(xì)胞蛋白定量。每孔吸取20 μl蛋白上樣，預(yù)先配置SDS-PAGE電泳分離，并將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別孵化一抗、二抗，5%的脫脂奶粉孵育，PBS洗膜3次，置膜于暗室中ECL試劑盒顯影，掃描儀采集圖像，Image J軟件系統(tǒng)分析Western blot檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CsA誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡MGC80-3細(xì)胞經(jīng)不同濃度CsA處理后，F(xiàn)CM檢測結(jié)果如圖1所示，CsA可濃度依耐性誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞發(fā)生凋亡，10 μmol/L CsA組凋亡率為(16.57±2.53)%，20 μmol/L CsA組凋亡率為(24.33±1.31)%，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.64，P<0.05，P<0.01)。

2.2 MGC80-3細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的改變結(jié)果如圖2所示，電鏡觀察顯示，CsA作用人胃癌MGC80-3細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生典型凋亡特征變化，如核染色質(zhì)固縮、核碎裂成碎片等；線粒體也出現(xiàn)損傷，線粒體膜的破裂、腫脹、空泡樣變性等現(xiàn)象(圖2C、2D中箭頭所示)。而對照組細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，嵴清晰完整(圖2A中箭頭所示)。

圖1 CsA對MGC80-3細(xì)胞凋亡影響

A：對照組；B：5 μmol/L濃度組；C：10 μmol/L濃度組；D：20 μmol/L濃度組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 電鏡觀察MGC80-3細(xì)胞發(fā)生凋亡特征性改變

A：對照組；B：5 μmol/L濃度組；C：10 μmol/L濃度組；D：20 μmol/L濃度組

2.3 CsA影響MGC80-3細(xì)胞內(nèi)Cytochrome C蛋白的表達(dá)在CsA處理MGC80-3細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)Cytochrome C蛋白表達(dá)量隨著藥物作用濃度的增加而明顯增加。實驗結(jié)果如圖3所示，CsA濃度為10、20 μmol/L組細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

我國是GC的高發(fā)地區(qū)，研究[6]顯示在河北省GC發(fā)病率和死亡率分別居各類癌癥第二位和第三位，成為當(dāng)?shù)氐闹饕膊∝?fù)擔(dān)。因此，針對GC尋找理想的治療手段成為當(dāng)務(wù)之急。CsA作為一種強效免疫制劑，是具有廣泛前景的抗腫瘤藥物，其有抗腫瘤細(xì)胞譜廣、毒性低的特點，聯(lián)合多種化療藥物能顯著誘導(dǎo)如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性髓性白血病等腫瘤細(xì)胞凋亡，并有協(xié)同增加化療藥物的抗腫瘤作用[7-8]。已越來越引起人們的關(guān)注。

圖3 CsA作用MGC80-3細(xì)胞Cytochrome C蛋白表達(dá)

A：對照組；B：5 μmol/L濃度組；C：10 μmol/L濃度組；D：20 μmol/L濃度組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

本研究結(jié)果顯示CsA作用48 h后能濃度依賴性誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡，電鏡也觀察到細(xì)胞發(fā)生典型凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞線粒體膜出現(xiàn)破裂、腫脹，嵴變短或消失；線粒體出現(xiàn)空泡樣變性，可能存在功能失活，表明其誘導(dǎo)凋亡的機制可能與線粒體受損有關(guān)。由于線粒體膜受損可改變線粒體通透性，會使△Ψm下降，致線粒體基質(zhì)腫脹，釋放促凋亡因子，如Cytochrome C，形成被稱為凋亡體的多聚體復(fù)合物，并啟動Caspase家族蛋白激活級聯(lián)反應(yīng)，最終細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。研究[10]表明：通過激活caspase-3、caspase-9和Cytochrome C蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞的凋亡。

本實驗前期研究[11]顯示CsA誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡與激活caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。而Cytochrome C作為細(xì)胞線粒體凋亡路徑重要信號蛋白，是否也參與了CsA誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡過程，本實驗利用Western blot法檢出了細(xì)胞內(nèi)Cytochrome C蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示CsA可促進細(xì)胞Cytochrome C蛋白表達(dá)；結(jié)合FCM結(jié)果，筆者推測CsA誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Cytochrome C蛋白表達(dá)有關(guān)聯(lián)。關(guān)于CsA是否通過線粒體凋亡信號通路誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡具體機制還有待于后續(xù)的研究進一步證實。

由于為線粒體細(xì)胞凋亡途徑在癌癥、糖尿病、肥胖、缺血/再灌注損傷等各種病理狀況中扮演著重要角色[9]，所以本實驗通過研究CsA靶位GC細(xì)胞線粒體功能，探討CsA誘導(dǎo)MGC80-3細(xì)胞凋亡的相關(guān)機制，這對于今后開發(fā)CsA作為免疫抑制劑在治療胃惡性腫瘤中的重要作用提供科學(xué)而有價值的信息。