張 宇，王洪波，朱振宇，任 輝，蒙 軒，劉振文

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是長期大量飲酒導(dǎo)致的第二大肝臟疾病，臨床表現(xiàn)為脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞壞死等，其嚴(yán)重危害人民的身體健康[1]。近年來不斷有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)對于諸多肝臟相關(guān)疾病，尤其在ALD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。研究[2]顯示ERS可以打破肝臟內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡與脂變。人參皂苷CK是人參皂苷在體內(nèi)發(fā)揮活性的主要形式，具有保護(hù)肝臟、抗炎、改善免疫功能、抗癌等藥理活性[3-4]。該研究基于建立大鼠酒精性肝臟損傷模型，從ERS反應(yīng)性角度研究人參皂苷CK對肝臟病理變化、細(xì)胞凋亡、超微結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)合成的影響，以期通過ALD發(fā)病機(jī)制尋找合適的抗酒精性肝病靶點(diǎn)藥物，對于有效預(yù)防和治療ALD有重要的理論和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

1.1.1動物 雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量280～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自江蘇碧云天生物科技；GRP78抗體、GAPDH抗體購自英國劍橋abcam公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物；蘇丹Ⅳ染色液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；人參皂苷CK(ZT-20093)購自上海甄準(zhǔn)生物公司；甘油三酯檢測試劑盒購自德國達(dá)姆施塔特sigma公司；注射用腺苷蛋氨酸購自德國基諾藥廠。

1.2 方法

1.2.1大鼠酒精性肝損傷動物模型的建立 將雄性SD大鼠10只作為對照組，剩余40只參考Wen et al[5]造模方法并加以改進(jìn)，每日予以56°白酒(10 ml/kg)、玉米油(2 ml/kg)、吡唑(25 mg/kg)混合物灌胃1次，每周腹腔注射0.3 ml/kg四氯化碳、橄欖油混合液(體積比1 ∶3)1次，連續(xù)10周，判斷酒精性肝損傷動物模型造模成功[6]。第11周起將造模大鼠隨機(jī)分為模型組和低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組，高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組，腺苷蛋氨酸陽性對照組(200 mg/kg)，采用腹腔注射給藥方式，每天1次，連續(xù)給藥2周，對照均采用同體積生理鹽水。然后處死，分離肝臟，分離原代細(xì)胞或肝臟標(biāo)本-70 ℃凍存。

1.2.2HE染色病理學(xué)檢測 取各組肝臟組織，100 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、75%乙醇脫水，每次各5 min，蒸餾水洗3次。染色后脫水透明，封固、光鏡觀察炎癥壞死等病變程度。

1.2.3Western blot檢測GRP78表達(dá) 取各組肝臟組織，RIPA細(xì)胞蛋白裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸法(BCA法)蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF膜恒流濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜成功的PVDF膜轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉l h。再將PVDF膜分別加入稀釋的GRP78、GADPH一抗(1 ∶2 000稀釋)，4 ℃輕搖過夜；隨后加入相應(yīng)的二抗(1 ∶1 000 稀釋)，37 ℃恒溫?fù)u床孵育l h。蛋白的相對表達(dá)量用待測蛋白與GADPH的灰度值比值計算。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測肝細(xì)胞凋亡 收集各組新鮮肝組織剪碎，置于100目銅網(wǎng)上輕搓，生理鹽水沖洗，2 500 r/min離心棄去上清及細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞懸液。參照《Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒》通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.5電鏡觀察各組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 分離各組肝臟原代細(xì)胞，2.5%戊二醛固定，反應(yīng)4 h；0.1 mmol/L磷酸緩沖液清洗3次；30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脫水各一次，每次20 min；100%乙醇脫水2次，每次20 min；乙酸異戊酯置換2次，每次20 min；將細(xì)胞均勻涂布蓋玻片上，-70 ℃冷凍12 h；冷凍干燥48 h；將蓋玻片樣品噴金粉后上樣，觀察。

1.2.6甘油三酯含量檢測 使用甘油三酯檢測試劑盒，甘油三脂總濃度通過偶聯(lián)酶促反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，在波長570 nm下檢測，其顏色深淺程度與樣品中甘油三酯的含量成正比。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷CK干預(yù)對酒精性肝損傷大鼠肝臟組織病理的影響HE染色病理學(xué)檢測結(jié)果顯示正常大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝血竇腔隙正常，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)明顯，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射性排列。模型組大鼠肝臟組織肝細(xì)胞索界限不清晰，肝細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)一定程度的空泡結(jié)構(gòu)；肝小葉中央靜脈周圍區(qū)域集中可見點(diǎn)狀或灶狀壞死變性，壞死區(qū)域存在大量侵潤炎癥細(xì)胞；肝細(xì)胞可見脂肪變性結(jié)構(gòu), 內(nèi)含大小不等的脂滴。低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組肝細(xì)胞基本恢復(fù)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇基本恢復(fù)正常，肝細(xì)胞濁腫明顯減輕，部分肝細(xì)胞處于氣球樣變。高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組與腺苷蛋氨酸陽性對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索、肝竇無明顯異常，細(xì)胞漿著色均勻，無明顯變性，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)較清晰，體積正常，但核質(zhì)略少，或分布不均，可見少量散在的肝細(xì)胞有輕度濁腫。見圖1。

2.2 人參皂苷CK干預(yù)抑制酒精性肝損傷大鼠肝臟ERS反應(yīng)Western blot檢測各組肝臟組織ERS標(biāo)志蛋白GRP78，結(jié)果顯示模型組GRP78蛋白表達(dá)量相對于對照組明顯升高，表明酒精刺激后的大鼠肝臟發(fā)生了ERS。低濃度(20 mg/kg)和高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)后均不同程度降低GRP78蛋白表達(dá)，其中高濃度(40 mg/kg)組GRP78表達(dá)接近正常組和腺苷蛋氨酸陽性對照組。表明人參皂苷CK干預(yù)可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的ERS反應(yīng)。見圖2。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理變化×200

A：正常組；B：模型組；C：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；D：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；E：腺苷蛋氨酸陽性對照組

圖2 Western blot檢測酒精性肝損傷ERS標(biāo)志蛋白GRP78蛋白表達(dá)

1：正常組；2：模型組；3：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；4：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；5：腺苷蛋氨酸陽性對照組

2.3 人參皂苷CK干預(yù)抑制酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測肝細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示正常組、模型組、低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組、高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組、腺苷蛋氨酸陽性對照組細(xì)胞總凋亡率分別為(10.23±0.98)、(24.01±1.76)、(13.66±0.65)、(11.04±0.88)、(9.92±0.71)。經(jīng)單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=90.95，P<0.05)。模型組較正常組細(xì)胞凋亡率顯著升高，高濃度(40 mg/kg)干預(yù)組較模型組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。表明人參皂苷CK干預(yù)可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的細(xì)胞凋亡。

2.4 人參皂苷CK干預(yù)改善酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察各組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，較正常組肝細(xì)胞，模型組細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯減少，線粒體增大，線粒體嵴結(jié)構(gòu)紊亂，時有線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失呈空泡樣改變；低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組肝細(xì)胞線粒體略有恢復(fù)，但基質(zhì)仍舊稀??；高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)及線粒體結(jié)構(gòu)明顯改善，可見大量線粒體，呈橢圓形，線粒體嵴結(jié)構(gòu)整齊，同正常組及腺苷蛋氨酸陽性對照組，見圖4。

2.5 人參皂苷CK干預(yù)對酒精性肝損傷大鼠肝臟脂質(zhì)合成代謝的影響檢測肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量結(jié)果顯示，正常組、模型組、低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組、高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組、腺苷蛋氨酸陽性對照組細(xì)胞甘油三酯含量分別為(24.76±1.53)、(38.25±1.97)、(31.15±1.77)、(28.81±1.21)、(27.64±1.36)。經(jīng)單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.71，P<0.05)。模型組較正常組顯著升高，高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明人參皂苷CK干預(yù)可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的肝細(xì)胞脂肪病變程度。

圖3 流式檢測酒精性肝損傷細(xì)胞凋亡

A:正常組；B：模型組；C：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；D：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；E：腺苷蛋氨酸陽性對照組

圖4 電鏡檢測酒精性肝損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)×100 000

A：正常組；B：模型組；C：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；D：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)組；E：腺苷蛋氨酸陽性對照組

3 討論

酒精性肝病作為長期以來主要肝臟疾病和研究重點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，除了酒精毒性削弱正常肝細(xì)胞的代謝及肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、損傷線粒體功能等[7-8]，越來越多學(xué)者開始關(guān)注ERS及其介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡可能在其中發(fā)揮的重要作用。如Yan et al[9]通過建立大鼠酒精性肝病模型，電鏡下觀察到模型組大鼠肝細(xì)胞的線粒體明顯受損，出現(xiàn)膜斷裂，嵴斷裂或消失，與對照組相比，模型組大鼠肝臟線粒體滲透轉(zhuǎn)運(yùn)通道PTP開放,導(dǎo)致線粒體腫脹，540 nm處吸收光度值A(chǔ)540減少(P<0.01)，模型組線粒體跨膜電位顯著降低且模型組線粒體質(zhì)量有明顯損害，胞內(nèi)鈣離子顯著增加，表明長期飲酒可引起肝細(xì)胞線粒體PTP開放，Ca2+外流，跨膜電位下降甚至崩潰，導(dǎo)致線粒體腫脹，引發(fā)肝細(xì)胞的凋亡或損傷。關(guān)慧[10]通過乙醇處理HepG2細(xì)胞建立酒精性肝損體外模型，結(jié)果表明乙醇組GRP78基因表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量增多，蛋白酶體活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是機(jī)體蛋白質(zhì)合成、運(yùn)輸?shù)闹饕獔鏊?，同時參與脂質(zhì)代謝的合成。當(dāng)某些因素使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，未折疊及錯誤折疊的蛋白質(zhì)增多，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積，會引起ERS。ERS進(jìn)而通過激活未折疊蛋白反應(yīng)信號傳導(dǎo)通路提高細(xì)胞生存能力[11-12]。其中，GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)駐留最多的分子伴侶，當(dāng)ERS發(fā)生、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白增多時，GRP78可與未折疊蛋白結(jié)合并幫助其正確折疊，因此GRP78被認(rèn)為是ERS發(fā)生的標(biāo)志性分子[13]。本研究顯示，大鼠肝臟在造模后GRP78蛋白表達(dá)量相對于對照組均顯著升高，表明酒精刺激后的大鼠肝臟發(fā)生了明顯的ERS反應(yīng)。此外，針對酒精性肝損傷模型組，病理結(jié)果顯示肝細(xì)胞索界限不清晰，肝小葉中央靜脈周圍區(qū)域集中可見點(diǎn)狀或灶狀壞死變性，壞死區(qū)域存在大量侵潤炎癥細(xì)胞；流式結(jié)果顯示促進(jìn)細(xì)胞凋亡；電鏡觀察結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯減少，線粒體增大，線粒體嵴結(jié)構(gòu)紊亂，時有線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失呈空泡樣改變；甘油三酯含量增加；均和上述研究理論及成果一致。

人參皂苷CK是天然二醇型人參皂苷在人體內(nèi)主要降解產(chǎn)物，是其發(fā)揮活性作用的主要形式，諸多研究[14]表明人參皂苷CK具有保護(hù)肝臟、抗炎、改善免疫功能、抗癌等藥理活性。如張雷明 等[15]用四氯化碳致大鼠慢性肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)人參皂苷CK可以有效降低血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST水平，顯著增加血清SOD的含量，表明CK對慢性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用可能與抗氧化有關(guān)。本研究顯示高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預(yù)可以明顯改善酒精性肝損傷大鼠肝臟組織病理病變，顯著降低肝損傷引起的GRP78蛋白表達(dá)量上調(diào)，抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的ERS反應(yīng)。人參皂苷CK干預(yù)可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的細(xì)胞凋亡及線粒體結(jié)構(gòu)損傷，可見線粒體嵴結(jié)構(gòu)整齊，形態(tài)正常。此外，有報道ERS可通過激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白促進(jìn)甘油三酯合成增多[16]，所以在該實驗中選取甘油三酯含量的測定作為ERS下游效應(yīng)的評估。結(jié)果表明人參皂苷CK干預(yù)明顯改善細(xì)胞脂肪變性情況，可明顯降低甘油三酯含量。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實ERS與酒精性肝病的關(guān)系，并且首次證明人參皂苷CK可抑制ERS，并在一定程度上防治酒精性肝病。人參皂苷CK干預(yù)可以明顯改善酒精性肝損傷大鼠肝臟組織病理病變，抑制ERS反應(yīng)，抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的細(xì)胞凋亡及線粒體結(jié)構(gòu)損傷，抑制脂肪病變程度。這為深入研究酒精性肝病損傷的發(fā)病機(jī)制，為臨床尋找理想的抗肝損傷藥物具有重要意義。