鄭媛萍 周連柱 孔繁芳 王忠躍

摘要為了明確葡萄灰霉菌對啶酰菌胺、多菌靈、咯菌腈、異菌脲、腐霉利、嘧霉胺的抗藥性

和對抑霉唑的敏感性，本試驗采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法檢測了采自山東蓬萊地區(qū)的69株葡萄灰霉菌對上述前6種殺菌劑的抗藥性、對抑霉唑的敏感性及抑霉唑與其他6種殺菌劑的交互抗性關(guān)系。結(jié)果表明，抑霉唑?qū)@69株葡萄灰霉菌的EC50分布在0.403～28.76 μg/mL之間，平均值為（9.34±10.34）μg/mL;葡萄灰霉菌菌株中抗啶酰菌胺（BosR）、多菌靈（CarR）、咯菌腈（FluR）、異菌脲（IprR）、嘧霉胺（PyrR）、腐霉利（ProR）的比例分別為100%、100%、9.47%、97.18%、100%、89.20%，測試菌株的抗藥性均為多抗類型，沒有單抗菌株，其中對3種殺菌劑（啶酰菌胺、多菌靈、嘧霉胺）、對4種殺菌劑（啶酰菌胺、多菌靈、異菌脲、嘧霉胺）、對5種殺菌劑（啶酰菌胺、多菌靈、異菌脲、嘧霉胺、腐霉利或啶酰菌胺、多菌靈、咯菌腈、異菌脲、嘧霉胺）和對6種殺菌劑（啶酰菌胺、多菌靈、咯菌腈、異菌脲、嘧霉胺、腐霉利）的抗性頻率分別為2.33%、9.30%、79.07%、2.33%、6.97%，表明啶酰菌胺、多菌靈、嘧霉胺對測試葡萄菌株完全喪失防效，建議在該葡萄產(chǎn)區(qū)停止使用這些藥劑，測試菌株對腐霉利、異菌脲的抗性頻率高，建議采取限制使用、禁止單獨使用等措施，測試菌株對咯菌腈的抗性頻率較低，可以繼續(xù)使用但需按照科學使用規(guī)則進行。抑霉唑與其他6種殺菌劑間不存在交互抗性關(guān)系，說明其可以和其他藥劑同時使用但建議減少使用。

關(guān)鍵詞葡萄灰霉菌;殺菌劑;抑霉唑;敏感性;抗藥性

中圖分類號：S 436.631

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018140

灰霉病已經(jīng)發(fā)展成為一種重要的世界性植物真菌類病害，由于其對經(jīng)濟造成嚴重影響，被列為世界第二大重大植物病原真菌病害[1]?；颐共“l(fā)生普遍，在經(jīng)濟作物的田間生長期及采后的貯藏、運輸過程中均有發(fā)生。其病原真菌灰葡萄孢可引起多種雙子葉農(nóng)作物及包括葡萄在內(nèi)的多種果蔬的灰霉病。葡萄灰霉病在我國各葡萄主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是葡萄成熟期和貯藏期的重要病害之一，在適宜的低溫高濕的環(huán)境下極易暴發(fā)，影響葡萄品質(zhì)，造成葡萄嚴重減產(chǎn)。目前，我國葡萄灰霉病的防控主要以化學防治為主，葡萄生產(chǎn)和貯存上主要使用的藥劑包括苯并咪唑類的多菌靈、二甲酰亞胺類的腐霉利和異菌脲、苯胺基嘧啶類的嘧霉胺、吡咯類的咯菌腈、煙酰胺類的啶酰菌胺、咪唑類的抑霉唑、有機硫類的福美雙等。隨著這些殺菌劑的高頻次和大劑量使用，灰葡萄孢也普遍產(chǎn)生了抗藥性甚至多藥抗性，造成葡萄生產(chǎn)和貯存上嚴重的經(jīng)濟損失[2]。據(jù)報道，2014年日本大阪地區(qū)溫室番茄灰霉菌對多菌靈、異菌脲的抗性頻率分別達到了74.2%和86.4%[3];2015年中國浙江地區(qū)草莓灰霉菌對腐霉利、嘧霉胺的抗性頻率分別達到了69.2%和93.7%[4]， 2017年德國東南部樹莓灰霉菌對咯菌腈、啶酰菌胺的抗性頻率均高達100%[5]。明確病原菌的抗藥性及抗藥性水平，是選擇有效藥劑的基礎(chǔ)。

14α脫甲基酶抑制劑（14αdemethylation inhibitors， DMIs）類殺菌劑是目前農(nóng)業(yè)上廣泛使用的甾醇生物合成抑制劑類殺菌劑，包含三唑類、咪唑類、嘧啶類和吡咯類[6]。DMIs通過抑制14α脫甲基酶，使真菌體內(nèi)的麥角甾醇生物合成受阻而起到抑菌作用[7]。抑霉唑（imazalil）是DMIs殺菌劑中咪唑類的重要成員，是一種內(nèi)吸性殺菌劑，該藥劑除用于水果、蔬菜和觀賞植物的真菌病害的防治外，在防腐、保鮮和延長水果貨架期方面，例如預(yù)防采后果蔬青霉病和綠霉病也具有卓越的功效[810]。自20世紀70年代抑霉唑在國外被用于柑橘防腐保鮮以來，研究者對其進行了大量研究。目前，該藥劑的理化性質(zhì)、抑菌效率、抑菌效力、毒性試驗、殘留量測定等均有報道[11]。我國于20世紀80年代初引進抑霉唑制劑，并進行了應(yīng)用試驗[12]，于20世紀90年代開始使用抑霉唑防治柑橘綠霉菌[13]。

抑霉唑因其良好的殺菌和防腐保鮮作用也被廣泛用作我國果蔬如葡萄成熟期的殺菌劑和貯藏期的保鮮劑，目前國內(nèi)外尚無灰葡萄孢對抑霉唑敏感性相關(guān)的研究報道，本研究旨在比較葡萄灰霉菌對抑霉唑及其他6種供試藥劑的敏感性，探究它們之間是否存在交互抗性，同時檢測山東葡萄灰霉菌對其他6種殺菌劑的抗性情況，以期為指導殺菌劑的使用及抗性檢測提供依據(jù)，減少葡萄成熟期和貯藏期灰霉病導致的損失。

1材料與方法

1.1菌株的采集、分離純化及保存

2016年從山東蓬萊葡萄主要種植區(qū)采集了灰霉病葉和病果樣品149份，裝入自封袋后用冰袋降溫保存。在實驗室內(nèi)對病樣進行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢后用接種環(huán)蘸取少量孢子進行劃線分離培養(yǎng)，1 d后挑取單個分生孢子進行培養(yǎng)，最終純化得到69株，切取帶菌培養(yǎng)基置于凍存管中，加入40%的甘油后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2供試藥劑與培養(yǎng)基

97%抑霉唑原藥、98%多菌靈原藥、98.4%腐霉利原藥、97%異菌脲原藥、98%咯菌腈原藥、97%嘧霉胺原藥、98.2%啶酰菌胺原藥均由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所農(nóng)藥應(yīng)用工藝學研究組提供。溶于甲醇或鹽酸，配制成20、50、100 mg/mL的母液，密封保存于4℃冰箱備用。

PDA培養(yǎng)基：將土豆去皮、洗凈吸干水分然后準確稱取200 g，切成厚度1.5 cm的土豆片放入1 L ddH2O中加熱煮至熟透。之后用雙層紗布過濾，棄濾渣，并用ddH2O將濾液定容到1 L，加入20 g葡萄糖，攪拌至全部溶解后分裝于含有3 g瓊脂的500 mL錐形瓶中，每瓶定容為300 mL，封口后121℃高壓滅菌20 min， 取出后搖勻，室溫下保存待用。

1.3葡萄灰霉菌對抑霉唑敏感性測定

采用菌絲生長速率法。抑霉唑的濃度梯度設(shè)置為0.5、1、2.5、5、10、20、40 μg/mL，另設(shè)置空白對照。使用前先將97%抑霉唑原藥溶解于適量甲醇配成20 mg/mL的母液并置于4℃儲存待用，試驗時按設(shè)置濃度稀釋，加入到熔化后冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中，并根據(jù)溶劑含量不得超過培養(yǎng)基總體積的0.5%的標準進行試驗。將分離純化并保存在-80℃的69株灰霉菌活化培養(yǎng)3 d后沿菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅接種到含藥PDA平板中央，以不加藥的空白PDA平板做對照，每次處理重復3次，置于22℃培養(yǎng)3 d左右，對照組菌落直徑達到平板的3/4左右時，用十字交叉法測量菌落直徑，利用SPSS 19.0軟件計算出抑霉唑?qū)Ω骶甑腅C50。

1.4葡萄灰霉菌對不同殺菌劑的抗藥性

采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法檢測葡萄灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的抗性頻率[14]，根據(jù)Bardas等[14]、Myresiotis等[15]的方法，設(shè)置多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的最小抑制濃度分別為10、5、5、1、5、1 μg/mL。其中多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、嘧霉胺抗藥性測定采用菌絲生長速率法。待熔化完全的PDA培養(yǎng)基冷卻至50℃加入定量的藥劑，制成含藥的PDA平板，并設(shè)置不含藥劑的空白對照。用直徑為5 mm打孔器打取活化的灰霉菌株菌落邊沿的菌餅，將菌餅菌絲面朝下接種在含藥的平板上，置于22℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察菌絲生長狀況?；颐共【鷮︵＞返目剐灶l率采用孢子萌發(fā)法進行測定：吸取事先制備好的孢子懸浮液均勻涂布在含藥WA平板上，22℃培養(yǎng)8～12 h后用顯微鏡觀察孢子的萌發(fā)情況。在空白培養(yǎng)基上長勢良好，不能在含藥培養(yǎng)基上生長或萌發(fā)的菌株為敏感菌株，而能在含藥培養(yǎng)基上生長或萌發(fā)的菌株為抗性菌株。統(tǒng)計敏感和抗性菌株的數(shù)量，計算抗性頻率。

1.5葡萄灰霉菌對抑霉唑及不同作用機制殺菌劑間的交互抗性

采用菌絲生長速率法測定69株灰霉菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、嘧霉胺的敏感性;采用孢子萌發(fā)法測定各菌株對啶酰菌胺的敏感性，設(shè)置空白對照。其中使用菌絲生長速率法測定抗藥性時，將活化好的菌株打制菌餅接種在含藥培養(yǎng)基平板上，22℃培養(yǎng)3 d左右，待對照組菌落直徑達到平板的3/4左右后采用十字交叉法測量菌落直徑;孢子萌發(fā)法則是22℃培養(yǎng)8 h左右，顯微鏡下隨機取3個視野觀察100個孢子的萌發(fā)數(shù)量，計算萌發(fā)率。每個處理重復3次。利用SPSS 19.0軟件計算出多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、嘧霉胺、啶酰菌胺對各菌株的EC50。利用SPSS 19.0軟件分析抑霉唑?qū)┰嚲甑膌gEC50分別與多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、嘧霉胺和啶酰菌胺對供試菌株的lgEC50之間的皮爾遜相關(guān)性。根據(jù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)和顯著性來判斷兩種殺菌劑之間是否存在交互抗性。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄灰霉菌對不同殺菌劑的抗藥性

69株葡萄灰霉菌中抗啶酰菌胺（BosR）、多菌靈（CarR）、咯菌腈（FluR）、異菌脲（IprR）、嘧霉胺（PyrR）、腐霉利（ProR）的比例分別為100%、100%、9.47%、97.18%、100%、89.20%（圖1），表明測試菌株已對多菌靈、啶酰菌胺、嘧霉胺產(chǎn)生了完全的抗藥性，對腐霉利和異菌脲產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，而對咯菌腈的抗性仍較低。對葡萄灰霉菌對這6種殺菌劑的多藥抗性分析結(jié)果（圖2）顯示，這69株葡萄灰霉菌株的抗性類型中不存在單抗類型，全部表現(xiàn)為多藥抗性，其中BosR_CarR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌靈、嘧霉胺）， BosR_CarR_IprR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌靈、異菌脲、嘧霉胺）， BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR （抗啶酰菌胺、多菌靈、咯菌腈、異菌脲、嘧霉胺），BosR_CarR_IprR_PyrR_ProR和 BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR_ProR（抗啶酰菌胺、多菌靈、咯菌腈、異菌脲、嘧霉胺、腐霉利）的頻率分別為2.33%， 9.30%，2.33%，79.07%，6.97%，數(shù)據(jù)顯示山東蓬萊地區(qū)的葡萄灰霉菌菌群的多藥抗性類型中以抗啶酰菌胺、多菌靈、異菌脲、嘧霉胺、腐霉利這5種殺菌劑的菌株為主。

2.2抑霉唑?qū)ζ咸鸦颐咕腅C50測定

采用菌絲生長速率法測定了69株野生葡萄灰霉菌對抑霉唑的敏感性，抑霉唑?qū)Ω骶甑腅C50最高達28.76 μg/mL，最低為0.403 μg/mL，不呈連續(xù)性單峰分布，使用SPSS軟件進行W法正態(tài)性檢驗，得到W=0.833，P=0.018，P<0.05，說明供試的69株葡萄灰霉菌對抑霉唑的敏感性頻率分布不符合正態(tài)分布（圖3）。其平均EC50為（9.34±10.34）μg/mL。

2.3葡萄灰霉菌對抑霉唑和6種殺菌劑的交互抗性

將抑霉唑?qū)?9株葡萄灰霉菌的EC50分別與多菌靈、腐霉利、異菌脲、啶酰菌胺、咯菌腈及嘧霉胺的EC50的對數(shù)值運用SPSS軟件進行皮爾遜相關(guān)性分析，其皮爾遜相關(guān)系數(shù)r分別為0.049（P>0.05）、0.025（P>0.05）、0.116（P>0.05）、0.134（P>0.05）、0.120（P>0.05）、0.017（P>0.05），數(shù)據(jù)顯示抑霉唑?qū)ζ咸鸦颐咕腅C50與其他6種類型殺菌劑EC50的相關(guān)性均未達到顯著水平，表明抑霉唑與多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺及嘧霉胺之間均不存在交互抗性（圖4）。

3結(jié)論與討論

3.1葡萄灰霉菌對6種殺菌劑的抗藥性

2014年日本大阪地區(qū)溫室番茄灰霉菌對多菌靈、異菌脲的抗性頻率分別到達了74.2%、86.4%[3]，2015年中國浙江地區(qū)草莓灰霉菌對腐霉利、嘧霉胺的抗性頻率分別達到了69.2%、93.7%[4]，2017年德國東南部樹莓灰霉菌對咯菌腈、啶酰菌胺的抗性頻率均高達100%[5]。這些數(shù)據(jù)說明，殺菌劑的長時間和大劑量使用，國內(nèi)外的灰葡萄孢均已經(jīng)產(chǎn)生了普遍的抗藥性，由此導致的殺菌劑防效下降的現(xiàn)象也日益嚴重。因此為減少灰霉病害引起的經(jīng)濟損失，科學合理地使用殺菌劑已成為葡萄以及其他經(jīng)濟作物生產(chǎn)上的迫切要求。

本研究表明，山東蓬萊地區(qū)葡萄灰霉菌對多菌靈、啶酰菌胺、嘧霉胺、腐霉利、異菌脲、咯菌腈均產(chǎn)生了抗藥性且抗性頻率分別為100%、100%、100%、89.20%、97.18%和9.47%，表明啶酰菌胺、多菌靈、嘧霉胺對測試葡萄菌株完全喪失防效，建議在該葡萄產(chǎn)區(qū)停止使用這些藥劑，腐霉利、異菌脲對測試菌株的抗性頻率高，建議采取限制使用、禁止單獨使用等措施，測試菌株對咯菌腈的抗性頻率較低，可以繼續(xù)使用但需按照科學使用規(guī)則進行。

3.2葡萄灰霉菌對6種殺菌劑的多重抗藥性

目前，國內(nèi)外已經(jīng)有很多關(guān)于灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、啶酰菌胺、咯菌腈及嘧霉胺的多藥抗性的報道[1618]，但是關(guān)于葡萄灰霉菌對主要殺菌劑的多重抗藥性（以下簡稱多藥抗性）的報道還較少。本研究結(jié)果表明，葡萄灰霉菌對上述殺菌劑的抗性類型中不存在單抗類型而全部表現(xiàn)為多藥抗性，其中測試菌株對啶酰菌胺、多菌靈、異菌脲、嘧霉胺和腐霉利的多藥抗性所占比例最高，達79.07%，但由于無法對該地區(qū)殺菌劑的使用情況進行準確的統(tǒng)計，有關(guān)于抗性的發(fā)展和殺菌劑的使用量間是否存在相關(guān)性的研究無法展開。

3.3葡萄灰霉菌對抑霉唑和6種殺菌劑的交互抗性

本研究是首次關(guān)于葡萄灰霉菌對抑霉唑和其他6種殺菌劑交互抗性情況的研究。測定了葡萄灰霉菌對抑霉唑的EC50，并對結(jié)果進行了統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，抑霉唑與多菌靈、腐霉利、異菌脲、咯菌腈啶酰菌胺及嘧霉胺之間均不存在交互抗性。在實際葡萄生產(chǎn)中，抑霉唑主要用于儲存期病害的控制，與上述6種殺菌劑的使用時間是不同的，且經(jīng)過試驗得出抑霉唑與上述藥劑不存在交互抗性，故其可以繼續(xù)作為葡萄儲藏期的保鮮劑，且咪唑類的其他藥劑也可繼續(xù)沿用。另外，如何通過藥劑的科學使用來減少葡萄灰霉菌對常用殺菌劑的交互抗性也是科研工作者需要去深入研究的方向。

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（責任編輯：楊明麗）