李國平 劉冰 黃建榮 邱峰 封洪強(qiáng)

摘要為明確轉(zhuǎn)聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因的抗蟲耐除草劑玉米的抗蟲性和對除草劑的耐受性，本文通過田間人工接蟲，以食葉級別、存活幼蟲數(shù)、蛀孔數(shù)、隧道長度和雌穗被害級別等分別作為評價玉米心葉期和穗期的抗蟲性標(biāo)準(zhǔn)，評價了轉(zhuǎn)聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因，具有抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀的玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR及同型非轉(zhuǎn)基因‘ND6708、‘ND6515和當(dāng)?shù)亍崋?58品種對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲的抗蟲效果;通過噴施除草劑后調(diào)查玉米植株的存活率，評價上述品種對除草劑的耐受性。田間試驗結(jié)果表明：‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個轉(zhuǎn)基因玉米品種對亞洲玉米螟、黏蟲及棉鈴蟲的抗性水平均為高抗，且在4葉期和8葉期噴施草甘膦后其受害率均為0，而同型對照品種和當(dāng)?shù)貙φ掌贩N噴施同劑量草甘膦后受害率為100%。綜上，聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因，具有抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀的玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲具有較強(qiáng)的抗蟲效果，對草甘膦具有較好的耐受性。此研究可為將來建立以轉(zhuǎn)Bt基因玉米為主要手段的綜合防治技術(shù)體系提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞亞洲玉米螟;黏蟲;棉鈴蟲;轉(zhuǎn)基因玉米;抗性

中圖分類號：S 435.13， S 513

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018151

世界上第一個轉(zhuǎn)蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis（簡稱Bt）cry1Ab基因的玉米于1996年在美國開始商業(yè)化種植，有效地控制了靶標(biāo)害蟲歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis （Hübner）的為害[1]。到2016年，美國的轉(zhuǎn)基因玉米種植面積達(dá)到3 500萬hm2，占玉米總種植面積的92%，其中抗蟲玉米占3%，耐除草劑玉米占13%，具有抗蟲和耐除草劑復(fù)合性狀的玉米占76%[2]。隨著Bt玉米的大面積種植，美國的歐洲玉米螟種群得到了有效控制，其不僅在Bt作物上的發(fā)生明顯減輕，且同一種植區(qū)內(nèi)其他非Bt寄主作物上種群數(shù)量也顯著降低[34]。在現(xiàn)有的玉米轉(zhuǎn)化體構(gòu)建中，cry1Ab和cry1F通常用于單基因和多基因的表達(dá)，而vip3A， cry2Ab2及cry1A.105只用于多基因的表達(dá)[5]。由于種植表達(dá)兩個基因的轉(zhuǎn)基因作物比種植表達(dá)單基因作物更能夠有效地延緩抗性的發(fā)生[6]， 種植轉(zhuǎn)多個基因作物在美國呈流行的趨勢。到目前為止，除美國外，巴西、阿根廷、加拿大、南非、烏干達(dá)、西班牙等17個國家批準(zhǔn)了商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因玉米，我國尚未商業(yè)化種植[2]。

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis （Guenée）、黏蟲Mythimna separata （Walker） 和棉鈴蟲Helicoverpa armigera （Hübner）是我國為害玉米的3種重要的鱗翅目害蟲[78]。亞洲玉米螟是玉米常年發(fā)生的第一大類害蟲，一般年份可造成春玉米減產(chǎn)10%左右，夏玉米減產(chǎn)20%～30%，大發(fā)生年份可致減產(chǎn)達(dá)50%以上[9]。黏蟲是一種暴食性害蟲，可以在小麥、玉米、水稻和其他作物上發(fā)生為害，暴發(fā)為害時植株葉片被大量取食，僅剩葉脈。2012年以來，黏蟲已經(jīng)對河北、河南、陜西、遼寧以及內(nèi)蒙古等地區(qū)的作物，尤其是玉米造成了嚴(yán)重的危害[8，1011]。棉鈴蟲是棉花上的重要害蟲，自20世紀(jì)80年代后期以來， 棉鈴蟲已成為我國夏玉米產(chǎn)區(qū)及遼寧南部春玉米穗期的主要害蟲， 該蟲主要取食玉米花絲、穗尖及籽粒，一般可造成減產(chǎn)5%～7%， 嚴(yán)重者減產(chǎn)10%以上，且常誘發(fā)玉米穗腐病的發(fā)生，影響品質(zhì)[12]。

Bt玉米對靶標(biāo)害蟲歐洲玉米螟有很好的控制效果， 但對其他鱗翅目害蟲的控制效果因所轉(zhuǎn)基因的不同而異。比如，西班牙種植的轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米對地中海蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides（Lefebvre）的控制效果在99%以上[13]，而當(dāng)?shù)氐囊环N黏蟲Mythimna unipuncta在該Bt玉米上的存活率卻高達(dá)80%以上[1415]。在我國，轉(zhuǎn)cry1Ab基因玉米對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲都具有較好的田間抗蟲效果[9，1619]。目前有關(guān)轉(zhuǎn)聚合cry1A.105和cry2Ab2基因玉米對亞洲玉米螟、黏蟲和棉鈴蟲田間抗蟲效果還未見報道，本文通過田間人工接蟲試驗研究了轉(zhuǎn)聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps玉米對這3種鱗翅目害蟲的抗蟲效果以及對草甘膦的耐受性，為將來建立以Bt玉米為主要手段的綜合防治技術(shù)體系提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試玉米品種

供試的轉(zhuǎn)聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗蟲抗除草劑復(fù)合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR及同型非轉(zhuǎn)基因玉米品種‘ND6708、‘ND6515均由孟山都公司提供，以‘鄭單958作為當(dāng)?shù)貙φ掌贩N。

1.2供試蟲源

試驗用亞洲玉米螟卵塊由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供;黏蟲卵由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供;棉鈴蟲卵為室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)的采自河南新鄉(xiāng)七里營的種群。

1.3試驗小區(qū)設(shè)計

試驗于2009年7月-10月在河南省新鄉(xiāng)市七里營進(jìn)行，試驗地周圍有500 m以上非玉米作物隔離帶?？瓜x性鑒定采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計、3次重復(fù)，每個小區(qū)面積為30 m2（5 m×6 m），行距60 cm，株距25 cm，8行區(qū)。不同小區(qū)間設(shè)有2 m寬的隔離帶，以避免害蟲在不同小區(qū)間擴(kuò)散。除必要的農(nóng)事操作外，生長期不施用任何殺蟲劑。

除草劑試驗采用裂區(qū)試驗設(shè)計，主區(qū)為兩個處理，即噴除草劑與不噴除草劑，副區(qū)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，5個品種，重復(fù)3次，小區(qū)面積為12 m2（5 m×2.4 m），小區(qū)行長5 m，行距0.60 m，4行區(qū)。不同小區(qū)間設(shè)有2 m寬的隔離帶。施用的除草劑為孟山都公司生產(chǎn)的41%草甘膦異丙胺鹽（glyphosate isopropylamine salt）水劑，采用馬來西亞進(jìn)口恒壓穩(wěn)流噴霧器進(jìn)行噴施。

1.4對亞洲玉米螟抗蟲性鑒定

分別在玉米心葉期（玉米植株6葉至8葉）和吐絲期接種亞洲玉米螟卵塊進(jìn)行抗蟲鑒定。在玉米心葉期，將亞洲玉米螟黑頭卵接入玉米心葉叢中，在吐絲期將黑頭卵接入雌穗新鮮花絲上。每株接2塊卵（約60粒），并掛牌標(biāo)記以便于調(diào)查記載。每小區(qū)接蟲30株。心葉期第1 次接蟲5～7 d 后，補(bǔ)接1 次。心葉期接蟲后，分別于第14天和21天逐株調(diào)查玉米心葉食葉級別，采用9級標(biāo)準(zhǔn)[20]。吐絲期接蟲后，在收獲前逐株調(diào)查幼蟲存活數(shù)、蛀孔數(shù)及隧道長度。

1.5對黏蟲抗蟲性鑒定

在玉米心葉期將初孵黏蟲幼蟲接入玉米心葉叢中，每小區(qū)接蟲30株，每株接種初孵幼蟲30頭。接蟲3 d后，進(jìn)行第2次補(bǔ)接，數(shù)量同第1次。在接蟲14 d后，采用農(nóng)業(yè)部953號公告10.1-2007的9級標(biāo)準(zhǔn)[21]， 調(diào)查玉米葉片食葉級別和幼蟲存活數(shù)。

1.6對棉鈴蟲抗蟲性鑒定

在玉米吐絲期將棉鈴蟲初孵幼蟲接到玉米花絲上，每小區(qū)人工接蟲30株，每株接種初孵幼蟲20～30頭，接蟲3 d 后，第2次補(bǔ)接，接蟲數(shù)量同第1次。人工接蟲后第14天和第21天，采用農(nóng)業(yè)部953號公告10.1-2007的標(biāo)準(zhǔn)[21]，逐株調(diào)查雌穗受害級別、每個雌穗存活幼蟲數(shù)和雌穗被害長度 （cm）。

1.7耐除草劑鑒定

分別在玉米4葉期和8葉期噴施41%草甘膦異丙胺鹽水劑各1次，施用濃度為1.68 kg/hm2，用藥后1周、2周和4周調(diào)查和記錄藥害癥狀（選取藥害癥狀最輕的5株），藥害癥狀分級按5級標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[22]，計算受害率。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

用單因素方差分析不同品種間的差異，百分?jǐn)?shù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，多重比較采用Duncans新復(fù)極差法，采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 進(jìn)行，顯著性檢驗水平均為P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因玉米對亞洲玉米螟的田間抗性

在玉米心葉期接種亞洲玉米螟卵塊，14 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR 兩個轉(zhuǎn)基因品種食葉級別分別為1.23級和1.21級，達(dá)到高抗水平，而其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N‘ND6708和‘ND6515食葉級別分別為4.88級和4.84級，當(dāng)?shù)貙φ掌贩N‘鄭單958食葉級別為5.38級（表1）。品種間食葉級別差異顯著（F4，14=12.768，P<0.000 1），‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種受害級別均小于其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N‘ND6708和‘ND6515及當(dāng)?shù)貙φ掌贩N‘鄭單958，且3個對照品種間差異不顯著（表1）。

在玉米心葉期接種亞洲玉米螟卵塊21 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種食葉級別為2.72級和2.47級，達(dá)到高抗水平，而其同型對照品種‘ND6708和‘ND6515的食葉級別則分別為6.44級和6.54級，‘鄭單958為6.93級（表1）。品種間受害級別差異顯著（F4，14 =244.852， P=0.000 1），‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種無顯著差異，均輕于其同型對照品種‘ND6708和‘ND6515以及‘鄭單958（表1）。

玉米收獲前剖稈調(diào)查顯示：‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個品種平均單株蛀孔數(shù)為0個，平均活蟲數(shù)為0頭，平均隧道長度為0 cm;與其相對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N‘ND6708、‘ND6515以及‘鄭單958的平均單株蛀孔數(shù)分別為1.11、0.91和1.24個，平均單株活蟲數(shù)分別為0.67、0.56和0.73頭，平均單株隧道長度為2.68、3.08和3.55 cm（表2）。蛀孔數(shù)、活蟲數(shù)、隧道長度在品種間差異顯著（F4，14=242.266，P=0.000 1;F4，14=262.362，P=0.000 8;F4，14=218.245，P=0.000 1），轉(zhuǎn)基因品種顯著低于非轉(zhuǎn)基因品種（表2）。表明‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR在玉米的營養(yǎng)生長和生殖生長階段對亞洲玉米螟的抗性均顯著高于其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸彤?dāng)?shù)貙φ掌贩N。

2.2轉(zhuǎn)基因玉米對黏蟲的田間抗性

在玉米心葉期接入初孵黏蟲，14 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的葉片食葉級別分別為1.40級和1.29級，達(dá)到高抗水平;而其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N‘ND6708和‘ND6515的葉片食葉級別分別為5.87級和5.78級，‘鄭單958食葉級別為7.14級（表3）。轉(zhuǎn)基因玉米食葉級別顯著低于其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸汀崋?58品種（F4，14=32.294 0，P=0.000 1） （表3）。

‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR植株上的平均單株活蟲數(shù)均為0頭;而其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N‘ND6708和‘ND6515的平均單株活蟲數(shù)分別為1.11頭和1.16頭，當(dāng)?shù)貙φ掌贩N‘鄭單958的平均單株活蟲數(shù)為1.11頭（表3）。轉(zhuǎn)基因玉米上的平均存活數(shù)目顯著低于其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸彤?dāng)?shù)貙φ掌贩N（F4，14 =142.576， P =0.000 1）。

由以上分析可以得知，轉(zhuǎn)基因抗蟲抗除草劑復(fù)合性狀玉米‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR對黏蟲的抗性顯著高于其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸汀崋?58品種。

2.3轉(zhuǎn)基因玉米對棉鈴蟲的田間抗性

在玉米吐絲期接入棉鈴蟲初孵幼蟲，14 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的雌穗受害級別分別為0.11級和0.04級，幼蟲存活數(shù)均為0頭，雌穗被害長度均為0 cm。而其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N‘ND6708和‘ND6515雌穗受害級別分別為0.61級和0.58級，幼蟲存活數(shù)分別為0.17頭和0.19頭，雌穗被害長度分別為0.22 cm和0.24 cm;當(dāng)?shù)貙φ掌贩N‘鄭單958雌穗受害級別為0.64級，幼蟲存活數(shù)為0.30頭，雌穗被害長度為0.31 cm，轉(zhuǎn)基因品種顯著低于非轉(zhuǎn)基因品種（雌穗受害級別：F4，14=110.569，P=0.000 1;存活幼蟲數(shù)：F4，14=16.858，P=0.000 1;雌穗被害長度：F4，14=34.034，P=0.000 1）（表4）。

21 d后，‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的雌穗受害級別分別為0.11級和0.08級，幼蟲存活數(shù)均為0頭，雌穗被害長度均為0 cm。而其同型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N‘ND6708和‘ND6515雌穗受害級別分別為0.64級和0.67級，幼蟲存活數(shù)分別為0.22頭和0.16頭，雌穗被害長度分別為0.29 cm和0.25 cm;當(dāng)?shù)貙φ掌贩N‘鄭單958雌穗受害級別為0.62級，幼蟲存活數(shù)為0.13頭，雌穗被害長度為0.28 cm。轉(zhuǎn)基因品種顯著低于非轉(zhuǎn)基因品種（雌穗被害率：F4，14=34.136，P=0.000 1;存活幼蟲數(shù)：F4，14=14.144，P=0.000 1;雌穗被害長度：F4，14=20.420，P=0.000 1）（表4）。

2.4轉(zhuǎn)基因玉米對草甘膦的耐受性

在4葉期噴施草甘膦1周后，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N顯示出了明顯的受害情況。其主要癥狀為玉米植株停止生長，葉片發(fā)黃枯萎，植株死亡。而抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR則無此現(xiàn)象發(fā)生。2周后，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N受害率達(dá)到100%，植株全部死亡;而抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的植株受害率為0（表5）。

在8葉期噴施草甘膦2周和4周后，抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀玉米品種‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR的植株受害率均為0，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N受害率均達(dá)到100%。

3結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)Bt基因玉米通過在生長季內(nèi)持續(xù)表達(dá)殺蟲蛋白，害蟲的初孵幼蟲通過取食其組織而被殺死在低齡狀態(tài)，從而達(dá)到田間控制作用[23]。因此，評價轉(zhuǎn)Bt基因玉米的田間抗蟲效果通常是采用其初孵幼蟲進(jìn)行抗性鑒定。本文通過人工接蟲，對聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗蟲耐除草劑玉米的抗蟲性和對除草劑的耐受性進(jìn)行了田間抗性評價，結(jié)果表明‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR兩個轉(zhuǎn)基因品種對河南新鄉(xiāng)玉米常發(fā)鉆蛀性害蟲玉米螟具有很好的抗蟲效果，對穗期棉鈴蟲的抗性也較高，對偶發(fā)性害蟲黏蟲也表現(xiàn)出了極高的抗性，同時‘ND6708YGRR和‘ND6515YGRR對草甘膦也表現(xiàn)出了很好的耐受性。表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)cry1A.105+cry2Ab2基因的MON89034相似的抗蟲效果[24]。

玉米在整個生長季常常遭受多種害蟲的為害，因此評價轉(zhuǎn)Bt基因玉米對多種害蟲的田間抗性效果， 能夠更全面地了解玉米轉(zhuǎn)化體的抗性譜，對于其適生區(qū)的種植具有很好的田間指導(dǎo)作用。在我國，亞洲玉米螟是玉米上的第一大害蟲，在全國玉米產(chǎn)區(qū)廣泛分布，而棉鈴蟲在黃淮海棉區(qū)、長江棉區(qū)等常年為害玉米[12]。黏蟲是一種典型的遷飛性偶發(fā)害蟲，在特殊年份會大發(fā)生[11]。因此，應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)胤N植作物類型及其害蟲種類，在同一地區(qū)合理使用抗蟲作物。種植表達(dá)Cry1A.105和Cry2Ab2蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米與我國目前已經(jīng)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同，Bt棉大多表達(dá)單一的Cry1Ac蛋白，而Cry1A.105和Cry2Ab2蛋白與其殺蟲機(jī)制不同，由于作用位點(diǎn)的增多，害蟲同時對兩種殺蟲基因產(chǎn)生抗性的幾率比單個基因低，可以延緩抗性的發(fā)展。因此，即使在黃淮海地區(qū)種植此類型的轉(zhuǎn)基因品種，其引起棉鈴蟲對Bt棉產(chǎn)生交互抗性的風(fēng)險也相對較小。

本文僅評價了轉(zhuǎn)聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因玉米對亞洲玉米螟、棉鈴蟲和黏蟲的抗性。但隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整、玉米耕作模式的改變以及氣候變化等多種因素的影響，為害玉米的害蟲種類也在不斷發(fā)生變化。目前，桃蛀螟Conogethes punctiferalis （Guenée）在玉米上為害逐年加重[25]，尤其在黃淮海夏玉米區(qū)，嚴(yán)重時在玉米果穗上的種群數(shù)量和為害程度甚至超過亞洲玉米螟，成為玉米穗期的主要害蟲[26]。在今后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的田間抗性鑒定時，需要進(jìn)一步研究其對桃蛀螟的抗性。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）