王保軍 胡云鵬 申光茂 劉懷

1.5代謝酶基因表達檢測

朱砂葉螨RNA提取、基因組DNA去除、反轉錄等步驟均按照相應試劑盒說明書操作并進行質量檢測。采用實時熒光定量PCR方法檢測6個P450基因，4個GST基因以及4個CarE基因在田間種群和室內敏感種群之間的表達差異，引物信息見表1。

實時熒光定量PCR采用 SYBR Green法檢測，以RSP18為內參基因。反應程序設置為：95℃ 預變性15 s;95℃變性 15 s，60℃退火加延伸30 s，40個循環(huán)。實時熒光定量 PCR反應體系為 20 μL，包括：2×SYBR master mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游特異性引物各0.5 μL、無菌去離子水8 μL。所有試驗設3個生物學重復，每個生物學重復有2個技術重復。采用 2-ΔΔCt法計算相對表達量[16]。并用 SPSS 16.0 軟件進行顯著性分析。

2結果與分析

2.1抗藥性測定結果

阿維菌素和丁氟螨酯對朱砂葉螨潼南種群的毒力最高，LC50分別為0.879 mg/L和2.19 mg/L，甲氰菊酯效果最差，LC50為8 014.9 mg/L。與室內敏感種群相比，朱砂葉螨潼南種群對田間施用較多的聯(lián)苯肼酯和噠螨靈已經產生了明顯的抗藥性，抗性倍數(shù)分別為敏感種群的55.8倍和32.0倍，對阿維菌素、丁氟螨酯和甲氰菊酯表現(xiàn)為低水平抗性。

2.2代謝酶活性檢測結果

為明確潼南田間種群對殺螨劑產生抗性的機制，對外源有毒物質代謝的3種重要解毒代謝酶P450、GST、CarE的活性進行了檢測，發(fā)現(xiàn)田間種群P450、GST的活性均顯著高于室內敏感種群，CarE活性雖比敏感種群高，但是未達到顯著水平（表3）。該結果表明田間種群對聯(lián)苯肼酯和噠螨靈抗藥性的提高可能是由于其體內P450和GST活性升高所致。

2.3代謝酶基因表達差異分析

2.3.1P450相關基因表達差異

與P450活性相關的基因表達檢測結果如圖1所示。其中CPR在P450酶系中起著傳遞電子的作用，是影響整個P450酶系功能的關鍵因子，通過檢測該基因的相對表達量發(fā)現(xiàn)，CPR基因在田間種群中的表達量為敏感種群的1.53倍，且差異達到顯著水平（P<0.05）。這一結果與P450活性檢測結果相符，表明P450活性的改變可能與其對聯(lián)苯肼酯和噠螨靈產生抗性有關。進一步分析P450基因的表達量也發(fā)現(xiàn)田間種群的CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1三個基因的表達量顯著提高，其中CYP392A28的變化最為明顯，比敏感種群上調了51.7倍，CYP392A26和CYP384A1則分別上調了2.75和2.41倍。另外兩個基因CYP389B1和CYP391A1的相對表達量雖然在田間種群中也有一定程度的提高，但是沒有達到顯著水平，推測它們在這兩種藥劑的代謝過程中所起的作用有限。

2.3.2GST相關基因表達量檢測

與GST活性相關的基因表達檢測結果如圖2所示。Mu家族的兩個GST基因，GSTM7和GSTM9的相對表達量在田間種群中均顯著提高，分別為敏感種群的10.96和4.03倍，且GSTM9具有很高的表達量，表明該基因可能在聯(lián)苯肼酯和噠螨靈的代謝過程中發(fā)揮重要作用。同時，Delta家族的GSTD1基因在田間種群的表達量與敏感種群之間也存在顯著性差異，上調了1.59倍，而同家族GSTD2基因的相對表達量反而在田間種群中出現(xiàn)了顯著的降低，僅為敏感種群的0.522倍，表明Delta家族的GST在抗性形成的過程中可能存在不同的分工。

2.3.3CarE相關基因表達量檢測

與CarE活性相關的基因表達檢測結果如圖3所示。CarE13和CarE23的相對表達量在田間種群和敏感種群中基本相同，沒有顯著性差異，與CarE活性檢測結果一致。而CarE4和CarE6的相對表達量雖然在田間種群中出現(xiàn)了一定程度的提高，分別為敏感種群的1.80和5.39倍，但由于這兩個基因的相對表達量均較低，推測它們對CarE活性的影響有限。

3結論與討論

本研究通過生物測定明確了朱砂葉螨潼南田間種群對5種常用殺蟲殺螨劑的敏感性，從LC50來看，阿維菌素和丁氟螨酯對該螨均有很好的防治效果，并且和室內敏感種群相比，田間種群對這兩種藥劑還沒有產生明顯的抗性。阿維菌素雖然已有較長的使用歷史，但一直具有出色的殺螨活性，田間抗性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示朱砂葉螨還未對其產生明顯的抗藥性[17]。丁氟螨酯是一種新開發(fā)的高效殺螨劑，2013年在我國登記上市。雖然在歐洲已監(jiān)測到田間二斑葉螨逐漸對丁氟螨酯產生抗藥性[18]，但國內目前還暫未有田間朱砂葉螨對其產生抗藥性的報道。本次抗性檢測的結果也表明這兩種藥劑可以作為優(yōu)良的替代或輪換藥劑用于潼南田間朱砂葉螨的防治。

聯(lián)苯肼酯和噠螨靈是現(xiàn)階段田間常用的專性殺螨劑。但生測結果顯示潼南田間朱砂葉螨已對這兩種殺螨劑產生了中等水平的抗藥性，在防控中有必要選用其他作用機制不同的藥劑進行輪換替代，以避免當?shù)厝~螨種群抗性的進一步發(fā)展。此外，雖然田間也時常使用菊酯類藥劑防治螨類，然而從甲氰菊酯對朱砂葉螨的LC50來看，效果并不理想。另有研究數(shù)據(jù)也表明亞致死劑量的菊酯類藥劑可能還具有使葉螨生殖力增強的作用，因此不推薦使用菊酯類藥劑開展害螨防治[19]。

有害生物可以通過提高體內解毒代謝酶活性來提高其對藥劑的代謝速度，這是田間種群對藥劑產生低、中抗性的主要原因[2021]。由于抗性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示朱砂葉螨田間種群對這幾種藥劑的抗性還未達到高抗水平，因此本研究選擇從代謝抗性角度分析可能參與相關藥劑代謝的酶和基因。通過檢測代謝酶活性發(fā)現(xiàn)，朱砂葉螨田間種群體內P450和GST的活性顯著高于室內敏感種群，而CarE活性則沒有顯著性差異，表明P450和GST活性的提高可能與其能夠及時代謝聯(lián)苯肼酯或噠螨靈有關。而相關基因表達差異的結果則顯示田間種群的CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1以及GSTM7和GSTM9等基因的表達量均有顯著提高，表明它們是蛋白水平酶活性增強的主要原因。雖然目前關于朱砂葉螨對聯(lián)苯肼酯和噠螨靈的抗性機制還鮮有報道，但在柑橘全爪螨Panonychus citri的研究中，Ding等[22]發(fā)現(xiàn)經噠螨靈脅迫后，柑橘全爪螨體內P450和GST活性會明顯提高，并且有多個P450基因對噠螨靈的藥劑處理表現(xiàn)出應激性表達現(xiàn)象，而CarE的活性在藥劑脅迫前后沒有顯著性差異。這與本研究的結果一致，證明朱砂葉螨對噠螨靈等專性殺螨劑的代謝抗性極有可能是由于P450和GST基因過表達，進而在蛋白水平引起酶活性的提高，增強了害螨對殺螨劑的代謝能力導致的。

綜上所述，本研究通過抗藥性監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)潼南朱砂葉螨田間種群對常用的殺螨劑聯(lián)苯肼酯和噠螨靈均產生了較高的抗藥性。甲氰菊酯的殺螨活性不高，阿維菌素和丁氟螨酯則具有較好的殺螨效果，可以作為替代藥劑使用。代謝酶活性以及基因表達檢測結果表明P450和GST可能協(xié)同參與了聯(lián)苯肼酯和噠螨靈的代謝過程，其中CYP392A28和GSTM9這兩個基因的作用可能最明顯，而CarE在此過程中所起的作用有限。

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（責任編輯：田喆）