鮑金平，陳賀駿濤，侯 梅，程 卉，蘇婧婧，李慶林

(1.安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心，安徽 合肥 230038；2.省部共建新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

在當今社會，腫瘤已經(jīng)成為威脅人體健康和生命的嚴重疾病之一，腫瘤在全球的發(fā)病率和病死率持續(xù)上升[1-3]。細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移是腫瘤的特點，而腫瘤血管生成是腫瘤生長轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。有報道稱腫瘤細胞本身能夠產(chǎn)生血管生成因子，誘導新生血管的生成，腫瘤不僅可以在原發(fā)部位浸潤生長，甚至從已存在的血管床中產(chǎn)生出新生血管系統(tǒng)，通過血管、淋巴管等途徑擴散至身體其他部位[4-5]。因此將血管生成作為靶點，已經(jīng)成為腫瘤防治的一個重要方向[6-7]。藤黃為藤黃科植物藤黃樹(GarciniahanbaryiHook. f.)分泌的一種具有攻毒蝕瘡、破血散結(jié)等功效的干燥樹脂[8]，在臨床上主要用于治療頑癬惡瘡、出血、損傷等，近年來發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗腫瘤活性。1984年呂歸寶等[9]首次從中藥藤黃中分離得到新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)，并且實驗表明GNA具有抗癌譜廣、毒性較低的特點。本研究通過體外實驗，探討了GNA對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)生長的抑制作用及其機制。

1 材料與儀器

1.1 試劑及細胞株 HUVECs：購于中國科學院上海細胞庫；GNA：從中藥藤黃中提取分離所得，純度大于99%，由安徽中醫(yī)藥大學GNA課題組提供；DMEM：HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液：Amersco公司；無支原體胎牛血清：上海恒遠生物科技有限公司；PBS：北京中杉生物技術(shù)有限公司；DMSO：Sigma公司；MTT：Amersco公司；DAPI：碧云天生物公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Caspase-3抗體：CST公司。

1.2 儀器 多功能酶標儀：美國MD公司；倒置熒光顯微鏡：Olympus 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；潔凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；電子精密天平：奧多利斯科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 藥液的配制 精密稱取GNA 2 mg，加入二甲基亞砜50 μL，振蕩混勻，再吸入1 mL無血清培養(yǎng)基，從中取出21 μL至含有完全培養(yǎng)基的離心管中，繼續(xù)加培養(yǎng)基至8 mL，配成濃度為8 μmol/L的GNA藥液，4 ℃避光儲存?zhèn)溆?，使用時用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整所需溶液濃度。

2.2 細胞培養(yǎng)與傳代 復蘇HUVECs，接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，每天觀察1次，待細胞狀態(tài)良好且長至一定程度需要傳代時，將細胞從培養(yǎng)箱中取出，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，吸入大約2 mL胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察到細胞固縮變圓后立即加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移細胞至離心管中，1 400 r/min離心5 min，結(jié)束后棄上層培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打細胞至分散，置于新的培養(yǎng)瓶中，隔日換液，待細胞生長穩(wěn)定后，供檢測使用。

2.3 MTT法測定GNA對HUVECs生長的抑制試驗 取處于對數(shù)生長期的HUVECs，采取常規(guī)方法消化收集細胞，制成5×104/mL單細胞懸液接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入GNA使其終濃度為0.5、1、2、4、8 μmol/L，同時設(shè)空白對照組，每組6個平行孔，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后，離心后棄上清液，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，棄上清液后加入DMSO低速振蕩10 min，應用酶標儀于490 nm處測光密度(optical density，OD)值，并計算細胞存活率。存活率=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常組OD值-空白對照OD值)×100%。

2.4 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 取處在對數(shù)生長期HUVECs，采用胰蛋白酶消化法收集細胞，細胞計數(shù)使?jié)舛葹?×104/mL，接種于含有新培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，換成含不同濃度GNA藥液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

2.5 DAPI熒光染色 取HUVECs經(jīng)胰酶消化收集，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為6×104/mL，每孔1 mL細胞懸液接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向各孔中加入不同濃度的GNA藥液，平行設(shè)空白對照組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。各孔中加入PBS沖洗，1 mL的4%多聚甲醛固定0.5 h，棄去固定液，PBS沖洗，加入DAPI染液，常溫下避光15 min，PBS沖洗2次，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜，次日棄去上清液，換成含不同濃度GNA的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集細胞，用PBS洗滌2次，1 400 r/min離心5 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL的PI染液混勻。室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

2.7 Western blot檢測Caspase-3蛋白表達 不同劑量GNA溶液處理24 h的HUVECs，消化收集后提取總蛋白，蛋白上樣量為20 μg，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、孵育抗體、曝光后，以β-actin為參照物，對蛋白條帶進行灰度值分析。

3 結(jié)果

3.1 GNA對HUVECs的增殖抑制作用 GNA 0.5、1、2、4、8 μmol/L均能有效抑制HUVECs的增殖(P<0.05)，且隨著GNA濃度的增加，其作用也逐漸增強，呈明顯的濃度和時間依賴性。通過公式計算得出GNA作用HUVECs 24、48 h的IC50分別為1.94、1.37 μmol/L。見圖1。

注：A.空白對照組；B、C、D、E、F分別為0.5、1、2、4、8 μmol/L GNA處理組；與空白對照組比較，*P<0.05

圖1MTT法檢測GNA對HUVECs存活率的影響(n=6)

3.2 GNA對HUVECs生長的影響 未加藥組HUVECs(A)較為飽滿，細胞折光性強，貼壁狀態(tài)良好，以簇狀生長為主；培養(yǎng)24 h后HUVECs(B)在GNA藥液培養(yǎng)基作用下，細胞數(shù)目明顯減少，出現(xiàn)不同程度的皺縮、變小、變圓，胞質(zhì)可見大小不等空泡的現(xiàn)象。見圖2。

圖2倒置顯微鏡下觀察GNA對HUVECs生長的影響(10×20倍)

3.3 GNA對HUVECs凋亡的影響 倒置熒光顯微鏡下空白對照組細胞呈現(xiàn)彌散均勻的微弱藍色熒光，而含GNA藥液組細胞核出現(xiàn)致密濃染的情況，表現(xiàn)出顯著的凋亡特征，且其作用呈濃度依賴性。見圖3。

3.4 GNA對HUVECs凋亡率的影響 與空白對照組比較，GNA能誘導HUVECs凋亡(P<0.05)，且其作用隨GNA濃度的增加而增加，呈濃度依賴性。見圖4。

注：A.空白對照組；B、C、D分別為1、2、4 μmol/L GNA處理組

圖3 DAPI單染觀察不同濃度GNA對HUVECs凋亡的影響(DAPI染色，10×20倍)

注：A.空白對照組；B、C、D分別為1、2、4 μmol/L GNA處理組

圖4流式細胞術(shù)檢測不同濃度GNA對HUVECs凋亡率的影響(n=3)

3.5 GNA對HUVECs中Caspase-3蛋白表達水平的影響 與空白對照組比較，GNA各劑量組作用HUVECs 24 h后Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，且其作用呈濃度依賴性。見圖5。

4 討論

藤黃作為一味常見的中藥，在中國有著悠久的應用歷史。近數(shù)十年來，國內(nèi)外眾多學者對藤黃進行了大量且深入的研究，藤黃及其主要活性成分藤黃酸的藥理作用廣泛，其中就包括了抗腫瘤、抗炎、抗菌等作用。因其在治療腫瘤方面呈現(xiàn)出顯著的療效，所以成為近年來天然藥物抗腫瘤研究的熱點。

注：A.空白對照組；B、C、D分別為1、2、4 μmol/L GNA處理組；與空白對照組比較，*P<0.05

血管新生是指從已存在的血管床中通過血管內(nèi)皮細胞增殖、芽生、遷移等過程形成新的毛細血管網(wǎng)，使其功能與局部的需要相適應的生物學過程[10]。有研究表明，腫瘤血管生成誘導腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，對腫瘤發(fā)展至關(guān)重要，以腫瘤血管生成為靶點的抗血管生成治療作為腫瘤治療新視野，已發(fā)展為重要的抗腫瘤策略[11-12]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，中藥對腫瘤血管新生有明顯抑制作用，有效減緩了腫瘤的生長和惡化速度，提高患者的生活質(zhì)量，已成為目前抗腫瘤研究的重要方向[13]。例如姜黃素顯著增加內(nèi)皮抑素的表達，明顯抑制Lewis肺癌小鼠模型血管內(nèi)皮生長因子的表達，從而抑制肺腫瘤的生長[14]；其抑制宮頸癌皮下移植瘤模型的基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達，進而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。

細胞凋亡是機體控制細胞過度增殖的一種細胞功能，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞是永生性細胞，而腫瘤的發(fā)生不僅與細胞增殖的異常相關(guān)，也與細胞異常的凋亡有關(guān)[16]。DAPI是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，不能通過活細胞膜，但卻能穿透擾亂的細胞膜而對核染色，經(jīng)藥物損傷后的細胞，細胞膜破損，DAPI染料易于通過細胞膜與核內(nèi)的雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生熒光。本實驗結(jié)果顯示，GNA作用于HUVECs后出現(xiàn)大量的凋亡細胞，且凋亡細胞的比例明顯高于空白對照組，表明GNA對HUVECs有明顯的抑制作用，其作用機制可能是通過誘導細胞實現(xiàn)的。