馬林龍，劉艷麗，曹 丹，龔自明，劉盼盼，金孝芳*

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064）

茶葉香氣是茶葉揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)人類嗅覺神經(jīng)綜合作用的結(jié)果，一般只占干物質(zhì)質(zhì)量的0.01%～0.05%，是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[1-2]。茶葉香氣形成的基礎(chǔ)是茶樹體內(nèi)生物合成并積累的香氣前體物質(zhì)，不同茶樹品種在香氣前體物質(zhì)的含量、組成比例以及內(nèi)含糖苷水解酶特性等方面存在較大差異，其制作的茶葉香氣類型也不同，因而形成各具特色的“品種香”[3-5]。隨著生活水平不斷提高，茶葉香氣品質(zhì)越來越受到人們的關(guān)注，尤其在高香或特異香型茶樹種質(zhì)資源開發(fā)利用上[6-7]。湖北是我國的產(chǎn)茶大省，但高香或特異香型茶樹品種卻非常稀少。近年來，茶葉科技工作者通過系統(tǒng)選育、雜交育種和分子育種等手段創(chuàng)制了一批表現(xiàn)優(yōu)良的茶樹品系，但對(duì)其香氣相關(guān)研究卻較少。

本研究采用感官審評(píng)法和頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（head-space solid-phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，同時(shí)采用氣味活度值（odour activity value，OAV）、主成分分析（principal component analysis，PCA）法和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structure-discriminant analysis，OPLSDA）法，以國家優(yōu)良茶樹品種福鼎大白茶為對(duì)照，對(duì)比分析湖北省6 個(gè)優(yōu)良茶樹品系所制綠茶的香氣感官特征和主要香氣成分，系統(tǒng)了解各個(gè)茶樹品系所制綠茶的主要呈香物質(zhì)和關(guān)鍵差異香氣成分，以期充分利用各品系的優(yōu)良特性和生產(chǎn)性能，促進(jìn)優(yōu)良茶樹品系的推廣應(yīng)用，同時(shí)為特異香型茶樹品種的選育研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福鼎大白茶、03-7-4、03-7-1、20-2-1、07-7-68、07-7-64、01-4-7 7 個(gè)供試材料均采自湖北省茶樹種質(zhì)資源圃。2013年將1 a生大小一致的6 個(gè)茶樹品系和對(duì)照組福鼎大白茶的茶苗栽植在四周空曠、地勢平坦、土壤結(jié)構(gòu)良好、肥力中等一致的試驗(yàn)田中，各品系種植實(shí)驗(yàn)小區(qū)面積為13.5 m2，3 次重復(fù)，隨機(jī)排列。種植方式：大行距150 cm，小行距40 cm，株距20 cm，雙行雙株側(cè)窩種植，栽培管理措施一致。2017年3月份采摘各品系春梢一芽二葉，制作烘青綠茶茶樣。制作工藝流程：攤放→殺青→揉捻→初烘→攤涼→復(fù)烘→攤涼包裝[8]。

癸酸乙酯（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supeclo公司；7890A GC儀、5975C MS儀、HB-5MS（30m×0.32mm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱 美國Agilent公司；HHS型恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Milli-RO PLUS 30純水機(jī)法國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評(píng)

根據(jù)GB/T 23776—2009《茶葉感官審評(píng)方法》[9]中名優(yōu)綠茶審評(píng)法，由3 名專業(yè)人員對(duì)樣品的香氣進(jìn)行感官審評(píng)。

1.3.2 HS-SPME

準(zhǔn)確稱取3.0 g茶樣放入萃取瓶中，加入90.0 mL沸水，加入2.00 μL的內(nèi)標(biāo)（90 mg/L癸酸乙酯），然后將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDM萃取頭（使用前于250 ℃老化15 min）SPME手持器通過瓶蓋的橡皮墊插入到萃取瓶中，在50 ℃水浴中平衡10 min，吸附50 min后，取出并立即插入GC儀的進(jìn)樣口中，解吸附3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器收集數(shù)據(jù)。

1.3.3 GC-MS聯(lián)用分析

GC條件：HB-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度240 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。

柱溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min。

MS條件：電子電離能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為50～600 u；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；MS傳輸線溫度為280 ℃。

1.3.4 香氣成分的定量和OAV計(jì)算

利用NIST11.L譜庫比對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行串連檢索和人工解析，質(zhì)譜匹配度大于90%作為物質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)。以癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，每個(gè)香氣成分質(zhì)量濃度按式（1）計(jì)算：

式中：Ci為某成分質(zhì)量濃度/（μg/L）；Cis為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（μg/L）；Ai為某個(gè)成分峰面積；Ais為內(nèi)標(biāo)峰面積。

OAV按公式（2）計(jì)算：

式中：Ci為某個(gè)成分質(zhì)量濃度/（μg/L）；Ti為該成分的氣味閾值/（μg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差、相關(guān)性分析；采用SIMCA-P 13軟件進(jìn)行PCA和OPLS-DA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹品系綠茶香氣成分分析

由表1可知，釆用HS-SPME-GC-MS對(duì)6 個(gè)茶樹品系所制綠茶的香氣成分進(jìn)行分析鑒定，共檢測到55 個(gè)主要香氣成分，其中41 個(gè)成分在所有樣本中均檢測出，為共性成分。6 個(gè)茶樹品系所制綠茶香氣總量在138.61～291.66 μg/L之間，均要顯著高于對(duì)照組，其中20-2-1的香氣總量最高，約為對(duì)照組2.5 倍。由表1可知，芳樟醇（14.53～41.74 μg/L）、壬醛（9.7 0～2 2.1 3 μ g/L）、 (Z)-己 酸 -3-己烯酯（3.05～66.31 μg/L）和香葉醇（5.30～24.18 μg/L）是所測樣品中質(zhì)量濃度較高的香氣物質(zhì)，其次是(E)-己-3-烯基丁酸酯、二甲硫、水楊酸甲酯、庚醛、癸醛等。已有研究表明，芳樟醇、壬醛、香葉醇、(Z)-己酸-3-己烯酯和二甲硫等物質(zhì)在綠茶香氣中含量較高，是綠茶香氣的主要成分[10-12]。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符。

不同茶樹品種鮮葉制成的茶葉在香氣風(fēng)格上存在較大差異，這種差異很大程度上是由于不同茶樹品種鮮葉的香氣前體物質(zhì)的含量、組成比例等差異引起的[4,13]。6 個(gè)茶樹品系在主要香氣成分含量上存在較大的差異，如03-7-1中的芳樟醇質(zhì)量濃度最高（41.74 μg/L）顯著高于對(duì)照組和其他品系；6 個(gè)茶樹品系中均有較高含量的壬醛，約為對(duì)照組的2 倍；(Z)-己酸-3-己烯酯對(duì)新茶香氣貢獻(xiàn)較大，在20-2-1中質(zhì)量濃度高達(dá)66.31 μg/L，顯著高于其他品系，約是對(duì)照組的20 倍；香葉醇在20-2-1（24.18 μg/L）和07-7-68（23.88 μg/L）中均表現(xiàn)出較高質(zhì)量濃度。(E)-己-3-烯基丁酸酯在20-2-1中質(zhì)量濃度高達(dá)35.05 μg/L，而在福鼎大白茶、03-7-1、07-7-68中質(zhì)量濃度僅為0.53、0.73、0.94 μg/L。新鮮綠茶特征性香氣成分二甲硫僅07-7-64略高于對(duì)照組，其他品系均不同程度低于對(duì)照組；6 個(gè)品系中水楊酸甲酯的含量均不同程度高于對(duì)照組；庚醛和癸醛在不同品系和對(duì)照組間雖有一定的差異，但差異幅度相對(duì)較小。其次，在含量相對(duì)較低的香氣組分中，不同的茶樹品系間同樣存在一定差異。如01-4-7中含有較高的吲哚，20-2-1和07-7-68中的δ-杜松烯質(zhì)量濃度分別為11.36、9.77 μg/L，均顯著高于其他所測樣品。甲苯、α-柏木烯、β-紫羅蘭酮和香葉基丙酮在對(duì)照組中的含量要顯著高于6 個(gè)品系，而各品系間差異相對(duì)較小。α-蓽澄茄油烯在20-2-1中質(zhì)量濃度為4.09 μg/L，而在對(duì)照組中未檢測出。01-4-7中未檢測到順-氧化芳樟醇，03-7-1中未檢測到葉醇；己酸甲酯僅在20-2-1中檢測到，質(zhì)量濃度為0.69 μg/L，苯僅在03-7-1中有少量存在。

表1 不同茶樹品系綠茶香氣成分Table 1 Analysis of aroma contents in green teasμg/L

2.2 不同茶樹品系綠茶香氣化合物種類分析

圖1 不同茶樹品系綠茶香氣化合物類型及比例Fig. 1 Relative abundance of each class of aroma components in green teas

所測樣品中共檢出55 種香氣化合物，包括醛類16 種，醇類9 種，酯類8 種，烯類8 種，芳香烴類7 種，酮類5 種和其他類2 種。由圖1可知，醛類和醇類化合物所占比例較高，其次為酯類，三者占到所測樣品香氣成分的58.55%～80.81%。醇類化合物在03-7-1中所占比例最大，為45.02%，而在20-2-1中所占比例最低為17.82%；醇類化合物中以芳樟醇和香葉醇所占比例較大。所測樣品香氣中醛類化合物所占比例為15.98%～33.40%，醛類化合物中以玫瑰香氣的壬醛、水果香味的庚醛，香橙味的癸醛和蘋果香味的己醛含量較高。所測樣品中酯類化合物占香氣平均比例為20.45%，其中以具有水果青香的(Z)-己酸-3-己烯酯、水果芳香的(E)-己-3-烯基丁酸酯以及強(qiáng)烈的冬青油香氣水楊酸甲酯等酯類化合物為主，其中20-2-1酯類化合物占香氣比例高達(dá)45.98%，遠(yuǎn)高于其他樣品。酮類、烯類、芳香類以及其他類化合物雖占香氣總量比例相對(duì)較小，但對(duì)綠茶香氣形成同樣有著關(guān)鍵作用[14-15]。烯類化合物主要以具有木香的δ-杜松烯、3-蒈烯和α-柏木烯為主；酮類化合物中的具有奶香的2,3-辛二酮，花香的β-紫羅蘭酮和清香的香葉基丙酮等含量較高，芳香類化合物則以甲苯和對(duì)二甲苯含量最高，這兩類化合物在6 個(gè)茶樹品系中含量明顯低于對(duì)照組；其他類化合物中的二甲硫是新鮮綠茶的一種重要的特征性香氣成分，所測樣品均含有較高的二甲硫。

2.3 不同茶樹品系綠茶香氣感官審評(píng)及相關(guān)性分析

表2 不同茶樹品系綠茶香氣感官審評(píng)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation of green teas

由表2可知，所有樣品均具有鮮、清、高等典型的綠茶香氣特征，香氣感官品質(zhì)得分在91.5～95之間，6 個(gè)品系香氣感官得分均要高于對(duì)照組福鼎大白茶。有研究表明，茶樹品種是決定茶葉香氣類型的主要因素之一，不同的茶樹品種即使栽培環(huán)境和加工工藝相同，在成茶香氣類型上也會(huì)存在非常明顯的差異[16-17]。由表1可知，01-4-7、20-2-1和03-7-1均帶有花香，香氣感官得分相對(duì)其他幾個(gè)品系要高?；诟鳂悠废銡饨M分含量（表1）與香氣感官得分（表2）結(jié)果，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，香氣組分中僅(E)-β-羅勒烯與感官得分有極顯著相關(guān)性（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.902，而與其他香氣組分均無顯著相關(guān)性。茶葉香氣是各個(gè)香氣組分綜合的結(jié)果，單個(gè)香氣組分很難全面反映茶葉香氣的總體特征，其次，僅以香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度反映對(duì)茶葉香氣貢獻(xiàn)存在一定的局限性[18]。因此，這些因素的存在可能是導(dǎo)致香氣組分含量與香氣感官得分無顯著相關(guān)性的重要原因之一。

2.4 不同茶樹品系綠茶香氣成分的OAV分析

研究表明，香氣物質(zhì)的氣味閾值對(duì)茶葉香氣有重要影響，OAV是綜合考慮香氣物質(zhì)的含量和氣味閾值，避免僅以香氣物質(zhì)含量反映其對(duì)香氣貢獻(xiàn)大小的誤區(qū)，是評(píng)價(jià)各化合物對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)重要性的方法[19-21]，一般認(rèn)為OAV大于1的成分可能對(duì)總體風(fēng)味有直接影響[22]?；诓煌铇淦废邓凭G茶香氣成分含量并通過文獻(xiàn)查找各香氣成分的氣味閾值[23-26]，對(duì)所測樣品進(jìn)行OAV分析。由表3可知，所測樣品中共得到9 個(gè)OAV相對(duì)較高的香氣成分，依次芳樟醇、癸醛、二甲硫、β-紫羅蘭酮、香葉醇、壬醛、庚醛、(E)-2-壬烯醛、(Z)-己酸-3-己烯酯。所測樣品各個(gè)香氣成分OAV存在一定的差異，如芳樟醇在03-7-1中OAV最大，為69.56，顯著高于對(duì)照組；除07-7-64同對(duì)照組相當(dāng)外，其余品系均不同程度高于對(duì)照組。含量相對(duì)較低的癸醛因氣味閾值較低，所有樣品均表現(xiàn)出較高的OAV，其中癸醛在07-7-64中的OAV高達(dá)87.09，可能是品系07-7-64中關(guān)鍵呈香物質(zhì)，而含量較高壬醛因氣味閾值較大，均表現(xiàn)出較低OVA。β-紫羅蘭酮在福鼎大白茶中OAV高達(dá)37.40，明顯高于其他品系，可能是福鼎大白茶中關(guān)鍵呈香物質(zhì)。(Z)-己酸-3-己烯酯在20-2-1中的OVA為6.63，明顯高于其他樣品，可能是20-2-1中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。(E)-2-壬烯醛僅在03-7-4、20-2-1和07-7-64中的OAV大于1；香葉醇在03-7-1、20-2-1和07-7-68中的OVA依次為5.06、7.56和7.46，顯著高于其他樣品；二甲硫和庚醛在不同樣品中的OAV雖有一定的差異，但差異幅度相對(duì)較小。

表3 不同茶樹品系綠茶主要香氣化合物OAV分析Table 3 OAV of important aroma compounds in green teas

2.5 不同茶樹品系綠茶香氣成分的PCA和OPLS-DA

圖2 不同茶樹品系綠茶香氣成分PCAFig. 2 PCA derived from integrated GC-MS datasets for green teas

PCA和OPLS-DA通過對(duì)樣品數(shù)據(jù)的歸納、整理和統(tǒng)計(jì)分析，較為客觀地反映樣品的微小變化、分類以及變化趨勢等[27-28]?；诓煌铇淦废邓凭G茶香氣成分的含量，利用SIMCA-P 13軟件進(jìn)行PCA。由圖2可知，6 個(gè)茶樹品系均遠(yuǎn)離對(duì)照組福鼎大白茶，說明6 個(gè)茶樹品系同對(duì)照組在香氣成分上存在較大的差異。同時(shí)，03-7-4、01-4-7、07-7-68和03-7-1 4 個(gè)品系聚為一類，說明這4 個(gè)茶樹品系所制綠茶香氣有一定的相似性。20-2-1和07-7-64分別單獨(dú)聚為一類，說明這2 個(gè)茶樹品系在所制綠茶的香氣上存在一定的特異性，20-2-1在香氣組成上含有較高的酯類化合物，且香氣總量最高；07-7-64在香氣組成上有高含量的醛類化合物。為進(jìn)一步了解影響不同茶樹品系聚類的主要香氣成分，利用SIMCA-P 13軟件對(duì)茶樹品系綠茶香氣成分的含量進(jìn)行OPLS-DA，從圖3A可知，不同茶樹品系的分類結(jié)果同PCA結(jié)果較為類似，進(jìn)一步驗(yàn)證PCA的結(jié)果。同時(shí)，一般認(rèn)為OPLS-DA形成的載荷圖里的化合物越是接近起點(diǎn)對(duì)樣品聚類的影響越小[29]，由圖3B可知，(Z)-己酸-3-己烯酯、(E)-己-3-烯基丁酸酯、(Z)-3-甲基丁酸-3-己烯酯等酯類化合物對(duì)樣品分類具有較大的貢獻(xiàn)，而芳樟醇、二甲硫、壬醛等含量高的香氣物質(zhì)反而對(duì)分類的影響較小。利用OPLS-DA形成的關(guān)鍵變量（variable inf l uence on projection，VIP）值的大小對(duì)不同茶樹品系所制綠茶香氣成分進(jìn)行關(guān)鍵變量分析，一般認(rèn)為VIP大于1為關(guān)鍵差異化合物[30]。由表4可知，共有19 種香氣成分的VIP值大于1，這些香氣物質(zhì)對(duì)6 個(gè)茶樹品系分類具有較大的貢獻(xiàn)，這些關(guān)鍵化合物在不同茶樹品系以及對(duì)照組中的含量存在較大的差異，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證酯類化合物對(duì)樣品分類影響較大。

圖3 不同茶樹品系綠茶香氣成分OPLS-DA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 3 OPLS-DA score plot (A) and OPLS-DA loading plot (B) derivedfrom integrated GC-MS datasets for green teas

表4 不同茶樹品系綠茶香氣成分OPLS-DA的VIPTable 4 Compounds with VIP values of more than 1 as determined by OPLS-DA in green teas

3 結(jié) 論

以優(yōu)良茶樹品種福鼎大白茶為對(duì)照，采用感官審評(píng)法和HS-SPME-GC-MS法對(duì)比分析湖北省6 個(gè)優(yōu)良茶樹品系所制綠茶香氣感官特征和主要香氣成分。所測樣品均具有鮮、清、高等典型的綠茶香氣特征，香氣感官品質(zhì)得分均高于對(duì)照組，其中01-4-7、20-2-1和03-7-1帶有花香，香氣感官得分相對(duì)較高。所測樣品共檢出55 個(gè)主要香氣成分，均以醛類和醇類化合物所占比例較高，其次為酯類，三者總共占到所測樣品香氣成分的58.55%～80.81%，而烯類、芳香烴類及其他類化合物所占香氣總量的比例較低。6 個(gè)茶樹品系綠茶香氣總量在138.61～291.66 μg/L之間，均要顯著高于對(duì)照組，其中20-2-1的香氣總量最高，約為對(duì)照組2.5 倍，可用于高香茶樹資源開發(fā)利用。芳樟醇、壬醛、(Z)-己酸-3-己烯酯和香葉醇是所測樣品中含量較高的香氣物質(zhì)，其次是(E)-己-3-烯基丁酸酯、二甲硫、水楊酸甲酯、庚醛、癸醛等，但不同茶樹品系間存在較大的差異。其次，在含量相對(duì)較低的香氣組分中，不同的茶樹品系間同樣存在一定的差異。

通過對(duì)香氣成分進(jìn)行OVA、PCA和OPLS-DA，系統(tǒng)了解各個(gè)茶樹品系所制綠茶的主要呈香物質(zhì)和關(guān)鍵差異香氣成分。結(jié)果表明：共得到9 個(gè)OAV相對(duì)較高的香氣成分，依次芳樟醇、癸醛、二甲硫、β-紫羅蘭酮、香葉醇、壬醛、庚醛、(E)-2-壬烯醛、(Z)-己酸-3-己烯酯，這些物質(zhì)對(duì)茶葉香氣形成有著重要的貢獻(xiàn)。PCA和OPLSDA表明，6 個(gè)茶樹品系與對(duì)照福鼎大白茶在香氣成分上存在較大的差異；03-7-4、01-4-7、07-7-68和03-7-1 4 個(gè)茶樹品系所制綠茶在香氣上有一定的相似性；20-2-1和07-7-64 2 個(gè)茶樹品系所制綠茶在香氣上存在一定的特異性，20-2-1在香氣組成上含有較高含量的酯類化合物且香氣總量高，07-7-64在香氣組成上有高含量的醛類化合物。利用OPLS-DA形成的VIP值對(duì)不同茶樹品系所制綠茶香氣成分進(jìn)行關(guān)鍵變量分析表明，共有19 個(gè)化合物為區(qū)分所測樣品的關(guān)鍵差異香氣成分。