鄭麗雪，王家皓，陳志鵬，齊 斌，王立梅*

（常熟理工學(xué)院 蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇 常熟 215500）

隨著人們對食品安全問題的關(guān)注度日益增強(qiáng)，天然防腐劑的開發(fā)應(yīng)用受到廣泛的重視。其中，微生物源防腐劑乳酸鏈球菌素（Nisin）早在1969年就被聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)為高效安全天然食品防腐劑，且目前有部分學(xué)者正在研究將Nisin應(yīng)用于食品包裝中；ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）于2003年10月被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑，美國、韓國和日本已經(jīng)允許將ε-PL應(yīng)用于食品保鮮防腐中；溶菌酶也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肉制品、水產(chǎn)品和乳制品等食品防腐中[1-4]。此外，乳桿菌細(xì)菌素、曲酸、納他霉素、羅伊氏菌素等微生物源防腐劑以及植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物精油在食品工業(yè)以及化妝品行業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用[5-11]。

近年來，具有抑菌活性的丙酸桿菌代謝物（丙酸桿菌細(xì)菌素）也備受關(guān)注，細(xì)菌素可通過多種機(jī)制抑制有害菌的生長[12-13]。法國羅地亞公司已經(jīng)開發(fā)得到一種含有丙酸桿菌細(xì)菌素的新型生物防腐劑，得到了美國食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，產(chǎn)品已在美國和歐洲市場上銷售[14]。孫帥等[15]將70%～80%的特氏丙酸桿菌代謝物與20%～30%的Nisin混合制成了一種新型生物防腐保鮮劑，這種保鮮劑天然安全無毒，而且抑菌譜廣，將此保鮮劑應(yīng)用于草莓的貯藏中，大大降低了草莓的呼吸強(qiáng)度，減緩了草莓的質(zhì)量損失率，降低了草莓的腐爛率。目前，國內(nèi)大量研究還是圍繞高產(chǎn)丙酸桿菌素菌株的制備[16]、培養(yǎng)基的優(yōu)化[17]、代謝物的抑菌活性[18]以及丙酸桿菌素的分離純化[19]等方面，對于高密度發(fā)酵生產(chǎn)丙酸桿菌細(xì)菌素的研究較少，而高密度發(fā)酵是進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的前提。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)單一碳源不利于丙酸桿菌的生長，丙酸桿菌的最適復(fù)合碳源為乳酸鈉、葡萄糖分別15、5 g/L，在此基礎(chǔ)上，研究還發(fā)現(xiàn)每隔24 h補(bǔ)加一次3 g/L的復(fù)合碳源，能最大程度地提高丙酸桿菌的抑菌活性[20-21]。目前高密度方面的研究都集中在丙酸桿菌生長所需的碳源上，對氮源的研究比較少。有研究報(bào)道玉米漿可以代替丙酸桿菌生長所需的最適氮源酵母粉，可以在一定程度上提高丙酸桿菌代謝物的抑菌活性[22]。據(jù)此，本研究嘗試將玉米酒糟清液作為丙酸桿菌發(fā)酵所需的氮源，因?yàn)榫圃闱逡号c玉米漿在堿度及營養(yǎng)物質(zhì)含量上基本相似[23]，兩者都含有蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、礦物元素及少量的淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)，且玉米酒糟來源充足，運(yùn)輸方便且物美價(jià)廉。另外，有報(bào)道細(xì)菌素是具有抗微生物活性的肽或蛋白質(zhì)[24-25]，本研究也將探討實(shí)驗(yàn)菌株所產(chǎn)丙酸桿菌素的性質(zhì)，分析其是否也屬于蛋白類物質(zhì)，為后續(xù)的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌種：Propionibacterium freudenreichii CS1420（保藏登記號CCTCC NO：M 2015050）、大腸桿菌（ATCC25922）均為常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心保存。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1B超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司；YXQLS-100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CR22G II型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；PE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FA604A型精密電子天平 上海精天電子儀器有限公司；XMARK型微孔板、分光光度計(jì)美國Bio-Rad公司；UV-2450型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；NicoletIS10傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將P. freudenreichii CS1420單菌落接種至改良胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培養(yǎng)基[14]中活化，30 ℃厭氧培養(yǎng)2.5 d。

1.3.2 擴(kuò)大培養(yǎng)

將種子液按照10%接種量接入裝有乳酸鈉（sodium lactate broth，SLB）培養(yǎng)基[14]的三角瓶中，30 ℃厭氧培養(yǎng)2.5 d。

1.3.3 分批發(fā)酵

將擴(kuò)大培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接種至裝有2 L SLB培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，發(fā)酵期間通入CO2使罐壓保持0.05 MPa，控制pH 6.0，發(fā)酵時(shí)間8 d。

1.3.4 分批補(bǔ)加復(fù)合碳源

分批補(bǔ)加的復(fù)合碳源為75%乳酸鈉和25%葡萄糖混合溶液。從高密度發(fā)酵的96 h開始，每隔24 h補(bǔ)加復(fù)合碳源和2 g/L的酵母粉，連續(xù)補(bǔ)充5 次，每次碳源、氮源分別補(bǔ)料100 mL，補(bǔ)料速率為10 mL/min，其余發(fā)酵條件參照1.3.3節(jié)。其中每次發(fā)酵時(shí)復(fù)合碳源補(bǔ)加量分別為2、2.5、3、3.5 g/L和4 g/L，進(jìn)行5 次發(fā)酵確定最佳復(fù)合碳源添加量。

1.3.5 分批補(bǔ)加復(fù)合氮源

分批補(bǔ)加的復(fù)合氮源為2 g/L酵母溶液與玉米酒糟清液混合液。玉米酒糟清液是將酒糟與蒸餾水按照質(zhì)量比1∶4配制，30 ℃攪拌3 h，5 000 r/min離心5 min，取上清液[26]。從高密度發(fā)酵96 h開始，每隔24 h補(bǔ)加2.5 g/L復(fù)合碳源和復(fù)合氮源，連續(xù)補(bǔ)充5 次，每次碳源、氮源分別補(bǔ)料100 mL，補(bǔ)料速率為10 mL/min，其余發(fā)酵條件參照1.3.3節(jié)。其中每次發(fā)酵時(shí)復(fù)合氮源補(bǔ)加量分別為酵母溶液與玉米酒糟清液體積比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，進(jìn)行5 次發(fā)酵確定最佳復(fù)合氮源添加量。

1.3.6 指示菌的制備

將活化好的大腸桿菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600nm為0.2，然后用無菌LB培養(yǎng)基稀釋100倍備用。

1.3.7 丙酸桿菌素的制備

將發(fā)酵液在4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，用2.5 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，再用10%酒石酸調(diào)至pH 5.5，然后將發(fā)酵液用截留分子質(zhì)量為3 000 u的超濾膜進(jìn)行超濾，去除較大分子物質(zhì)，得到丙酸桿菌素粗提清液。

1.3.8 硫酸銨沉淀丙酸桿菌素的制備

將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min離心5 min，分別取離心上清液20 mL，邊攪拌邊緩慢向上清液中添加硫酸銨粉末（冰水?。?，至硫酸銨終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%，繼續(xù)攪拌均勻，放于4 ℃冰箱中沉淀過夜，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將離心后的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.9 抑菌活性的測定

參照文獻(xiàn)[27]并適當(dāng)改進(jìn)。將丙酸桿菌素粗提物用無菌的LB溶液進(jìn)行2n梯度稀釋，然后將不同稀釋倍數(shù)的抑菌物質(zhì)分別加入96 孔酶標(biāo)板中，每孔總體積為200 μL，其中20 μL為不同稀釋倍數(shù)的抑菌物質(zhì)，180 μL為指示菌菌液。用20 μL空白LB液體培養(yǎng)基和180 μL指示菌菌液作為對照，將酶標(biāo)板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取出用酶標(biāo)液測定各加樣孔在600 nm波長處OD值。當(dāng)OD600nm為對照組一半時(shí)的稀釋度定義為一個(gè)抑菌活性單位，單位為AU/mL。

1.3.10 丙酸桿菌素的結(jié)構(gòu)表征

1.3.10.1 紅外光譜分析

取一定量充分干燥后的丙酸桿菌素，將其與一定量的KBr混勻后壓片，在400～4 000 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[28]。

1.3.10.2 蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)[29]

抑菌活性檢測：向牛津杯中加入250 μL溶液，將檢測平皿放置在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察抑菌效果。

蛋白酶敏感性檢測：用胰蛋白酶和中性蛋白酶對硫酸銨鹽析沉淀溶液進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，首先調(diào)節(jié)硫酸銨鹽析沉淀溶液的pH值至兩種酶的最適作用值（pH 7.0、pH 2.0），各取1 mL分別加入兩種酶，使酶終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，37 ℃水浴2 h，100 ℃加熱l min滅酶，之后將pH值回調(diào)，進(jìn)行抑菌活性檢測，以未經(jīng)酶處理的70%硫酸銨鹽析沉淀溶液作為對照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

實(shí)驗(yàn)涉及數(shù)據(jù)處理均采用Excel 2016完成，所有作圖均采用Origin 8.5完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批發(fā)酵對丙酸桿菌生長的影響

圖1 丙酸桿菌分批發(fā)酵規(guī)律曲線Fig. 1 Time courses of mycelial growth and antibacterial activity of propionin in fed-batch fermentation of P. freudenreichii

從圖1可以看出，從96 h開始，丙酸桿菌菌體干質(zhì)量增加緩慢，這表明從96 h開始丙酸桿菌的生長受到限制，其抑菌活性基本保持不變，最高抑菌活性為17.6 AU/mL。丙酸桿菌素的發(fā)酵過程中，不斷分解利用還原糖，在進(jìn)入發(fā)酵穩(wěn)定期前大量消耗還原糖。在發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后，丙酸桿菌素開始大量合成，由于其可能是蛋白質(zhì)，而此時(shí)發(fā)酵液中還原糖和氨基氮含量已經(jīng)很低，限制了其高效合成[20]。通過分批補(bǔ)加碳源和氮源的方式有助于丙酸桿菌在穩(wěn)定期后高效合成丙酸桿菌素，提高丙酸桿菌素的產(chǎn)量。

2.2 分批補(bǔ)加復(fù)合碳源對丙酸桿菌素發(fā)酵規(guī)律的影響

圖2 分批補(bǔ)加復(fù)合碳源對丙酸桿菌素發(fā)酵規(guī)律的影響Fig. 2 Effect of supplementation of carbon sources on mycelial growth and antibacterial activity of propionin

從圖2可以看出，當(dāng)混合碳源添加量在2.5 g/L時(shí)，丙酸桿菌相對生長較好，菌體干質(zhì)量最高，在該條件下的丙酸桿菌素抑菌活性最高，可以達(dá)到30.5 AU/mL。丙酸桿菌能在葡萄糖、半乳糖、乳糖、阿拉伯糖等單一碳源培養(yǎng)基上生長[21]。而乳酸鹽是丙酸桿菌可高效利用的碳源，其中乳酸鈉是培養(yǎng)丙酸桿菌最常用的碳源[30]。而葡萄糖是工業(yè)生產(chǎn)中常用的碳源，研究表明丙酸桿菌在含有葡萄糖和乳酸鹽的組合培養(yǎng)基中能更好地利用乳酸鹽，從而提高丙酸桿菌素的產(chǎn)量[21]。因此該復(fù)合碳源最佳添加量為2.5 g/L。

2.3 分批補(bǔ)加復(fù)合氮源對丙酸桿菌素發(fā)酵規(guī)律的影響

圖3 分批補(bǔ)加復(fù)合氮源對丙酸桿菌素發(fā)酵規(guī)律的影響Fig. 3 Effect of supplementation of nitrogen sources on mycelial growth and antibacterial activity of propionin

從圖3可看出，當(dāng)酵母溶液與玉米酒糟清液體積比為1∶30時(shí)，丙酸桿菌的生長旺盛，菌體干質(zhì)量相對較高，同時(shí)在此條件下發(fā)酵得到的丙酸桿菌素的抑菌活性最高，可以達(dá)到31.2 AU/mL。2 g/L酵母溶液是丙酸桿菌發(fā)酵最佳補(bǔ)加氮源[20]，但酵母價(jià)格較高，工業(yè)化生產(chǎn)成本較大，而玉米和普通酒糟中都富含氨基酸，玉米酒糟中氨基酸含量很高，可以提供足夠的氨基氮，促進(jìn)合成丙酸桿菌素，而且玉米酒糟價(jià)格低廉，可以大大降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。因此該復(fù)合氮源最佳比例為1∶30。

2.4 丙酸桿菌素的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 紅外光譜分析[31-32]

圖4 丙酸桿菌素紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectrum of propionin

從圖4可見，肽鏈官能團(tuán)—NH—CO—的特征吸收譜帶。1 558 cm－1附近的吸收表示N—H相對于C=O以反式構(gòu)型的形式存在；1 408 cm－1附近的吸收是順式構(gòu)型。這些吸收包含N—H彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)的因素。1 638 cm－1的強(qiáng)吸收為肽鍵中的C=O雙鍵的伸縮振動(dòng)。2 976 cm－1和2 900 cm－1處的峰為飽和烷烴的C—H伸縮振動(dòng)峰。3 412 cm－1處的寬峰為酰胺鍵中的N—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。

2.4.2 丙酸桿菌素蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)

表1 丙酸桿菌素蛋白酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Proteolytic sensitivity of propionin

圖5 70 0%硫酸銨沉淀物抑菌效果與蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)Fig. 5 Antibacterial activity and proteolytic sensitivity of bacteriocin precipitated with 70% ammonium sulphate

對丙酸桿菌素溶液進(jìn)行蛋白酶解檢測，結(jié)果如表1和圖5所示，70%硫酸銨鹽析沉淀溶液經(jīng)胰蛋白酶和中性蛋白酶反應(yīng)后，抑菌活性無。結(jié)合丙酸桿菌素的紅外圖譜以及其蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)可以確定，P. freudenreichiiCS1420產(chǎn)丙酸桿菌素是具有抑菌活性的蛋白類物質(zhì)。

3 結(jié) 論

以分批補(bǔ)加碳源氮源的高密度發(fā)酵方法提高丙酸桿菌的生長量及其丙酸桿菌素的抑菌活性。創(chuàng)新性地在其發(fā)酵過程中用玉米酒糟清液代替部分酵母溶液作為碳源，在一定程度上提升了丙酸桿菌素的抑菌活性。研究得出兩個(gè)結(jié)論：1）分批添加復(fù)合碳源和復(fù)合氮源后，分批發(fā)酵制得的丙酸桿菌素的抑菌活性從17.6 AU/mL提高到31.2 AU/mL；2）由P. freudenreichiiCS1420產(chǎn)生的丙酸桿菌素是具有抑菌活性的蛋白類物質(zhì)。

來源于乳品中的丙酸桿菌素非常適合作為生物防腐劑作用于食品中，我國對丙酸桿菌素的應(yīng)用研究較少，因此本研究為丙酸桿菌素的工業(yè)化生產(chǎn)作了一定鋪墊，將對推動(dòng)丙酸桿菌素的應(yīng)用起一定作用，將激發(fā)其作為新型綠色安全防腐劑的潛力。