霍 超，盧海強，劉曉宇，李 琪，高 潔，桑亞新*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）屬于黃曲霉毒素類化合物，基本結(jié)構(gòu)為一個羥基取代基的二呋喃環(huán)與一個氧雜萘鄰?fù)猍1]。奶牛食用黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染飼料后，肝臟中的P450細胞色素酶將AFB1代謝成AFM1并分泌到牛奶中。人們飲用這種牛奶后，會對健康構(gòu)成巨大威脅[2]，乳制品的AFM1污染在全球多地已有報道[3]，解決乳制品中AFM1污染的問題刻不容緩。

降低AFM1污染的方法有化學(xué)法、物理法和生物法，其中生物法是公認的綠色、高效的脫毒方法[4]。已報道的生物脫毒法將乳酸菌或其他微生物直接加入食品中，抑制食品加工貯藏過程中的霉菌生長，可以降低黃曲霉毒素的污染風(fēng)險[5]；酶制劑直接降解黃曲霉毒素，已報道的有黃曲霉毒素解毒酶和葡萄糖氧化酶[6-7]，通過降解飼料中的AFB1來降低動物性食品中的AFM1[8]；通過微生物的吸附作用減少黃曲霉毒素含量，牛奶中加入鼠李糖乳桿菌能夠降低AFM1含量[9]。國內(nèi)對黃曲霉毒素降解菌處于篩選階段，缺乏進一步研究，黃曲霉毒素降解酶基因公布較少、適用性不強，給降解酶機理的研究和食品行業(yè)應(yīng)用帶來困難[10]。

為通過生物手段脫除AFM1，本實驗室通過篩選得到1 株短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus E-1-1-1），其胞外酶可以降解AFM1，降解率可達92.5%[11]，并進行了純化等研究，在AFM1的酶法降解中取得了一定的成果。CotA漆酶是一種從芽孢桿菌孢子層中分離的蛋白質(zhì)，含有3 個Cu2+結(jié)構(gòu)域，能夠氧化多數(shù)真菌漆酶底物[12]，漆酶是一種含Cu的多酚氧化酶，含有多個Cu2+結(jié)構(gòu)域，可以通過O-Cu間的電子傳遞形成高電位，對多環(huán)芳香族有很好的降解作用[13]。據(jù)報道，漆酶具備有效降解AFB1的能力[14]，而對于AFM1的研究鮮有報道。

本研究對B. pumilus E-1-1-1來源的cotA基因克隆表達，并對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進行表征，進一步探究了CotA漆酶在AFM1降解中的潛力，這為生物法降解AFM1提供了新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B. pumilus E-1-1-1、Escherichia coli（BL21）、表達載體pET-30a（+）和SMMC-7721肝癌細胞均為本實驗室保存。

pEASY-T1克隆試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑，限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI，T4 DNA連接酶寶生物工程（大連）有限公司；蛋白提取試劑盒、Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒 康為世紀生物科技有限公司；AFM1酶聯(lián)免疫試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為市售分析純，引物合成和核酸測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL 16M高速臺式離心機 湖南易達公司；Tprofessional PCR儀 德國Biometra公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；JY04S-3E型凝膠成像系統(tǒng)北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；1260高效液相色譜儀（配有熒光檢測器） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆及生物信息學(xué)分析

B. pumilus E-1-1-1接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，獲得B. pumilus E-1-1-1總基因組DNA。

參考已報道B. pumilus SH-b9 cotA基因（登錄號為UP12_RS03245）序列信息設(shè)計表達引物：cotA-PF：5’-CGAATTCCATCATATATAGATATTGTTGGAGA GC-3’（下劃線為EcoRI酶切位點）；cotA-PR：5’-AATG CGGCCGCTTATATCCATCGGCCG-3’（下劃線為NotI酶切位點）。

以B. pumilus E-1-1-1基因組作為模板，進行PCR擴增。PCR擴增條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30 個循環(huán)；72 ℃、10 min。擴增產(chǎn)物參照快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書，切膠回收后與pEASY-T1載體連接構(gòu)建pEASY-T1-cotA質(zhì)粒。轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細胞，并通過篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，分析測序基因序列，將含陽性基因序列的質(zhì)粒進行后續(xù)實驗。

依據(jù)cotA基因的測序結(jié)果，使用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析潛在信號肽剪切位點。使用NCBI的BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行相似性比對，使用Clustalx軟件將該序列與其他來源的漆酶序列進行保守序列分析。利用ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測CotA蛋白的分子質(zhì)量和等電點。

1.3.2 表達載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達

使用EcoRI和NotI雙酶切處理pEASY-T1-cotA和pET-30a（+），使用膠回收試劑盒對目的酶切產(chǎn)物進行回收，使用T4 DNA連接酶進行cotA和pET-30a（+）的連接反應(yīng)，得到重組表達載體pET-30a-cotA，轉(zhuǎn)化E. coli（DE3）表達菌株中，采用菌液PCR擴增目的片段鑒定陽性克隆子，并將陽性克隆子交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，對測序正確的菌株進行誘導(dǎo)表達。含pET-30a-cotA的BL21接入含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min過夜活化。次日以1%接種量轉(zhuǎn)接,菌液OD600nm達到0.8后，加入異丙基硫代半乳糖苷終濃度0.5 mmol/L和CuSO4終濃度5 mmol/L，于22 ℃恒溫培養(yǎng)14 h，測定細胞破碎液的漆酶活力。

1.3.3 重組漆酶的純化

含重組質(zhì)粒的E. coli（DE3）菌株，經(jīng)誘導(dǎo)表達后，5 000 r/min離心10 min收集菌體。向收集到的菌體中加入蛋白質(zhì)抽提試劑，置于室溫反應(yīng)15 min，冰水浴超聲10 次，每次12 s，10 000 r/min離心5 min去除細胞碎片，收集上清液使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測，收獲的上清液加入鎳柱純化，使用不同咪唑濃度濃度的洗脫液NTA-20、NTA-80和NTA-200洗脫重組漆酶[10]，分別收集不同濃度的洗脫液，對各洗脫液進行漆酶活力測定。

1.3.4 漆酶活力的測定

使用50 μL的酶液與150 μL 5 mmol/L的2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）混合，反應(yīng)1 min后立即沸水浴5 min，測定420 nm波長處吸光度，ABTS的氧化導(dǎo)致420 nm波長處的吸光度增加（ε=36 000 L/（mol·cm））。一個酶活力單位定義為每毫克蛋白每分鐘氧化1 μmol底物的酶量[15]。酶活力計算如式（1）所示：

式中：A為420 nm波長處的吸光度；V為溶液總體積/μL；ε為摩爾吸光系數(shù)；t為反應(yīng)時間/min；V0為加入漆酶體積/μL。

1.3.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.5.1 最適溫度和最適pH值測定

將純化的酶液加入pH 4.5緩沖溶液中，分別在20～90 ℃（每10 ℃為1 個梯度）放置1 min后測定漆酶活力，確定重組漆酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液置于不同pH值（3.0～10.0）緩沖液并在最適溫度下進行酶促反應(yīng)，測定酶活力確定重組漆酶的最適pH值。

1.3.5.2 溫度穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性測定

將純化的酶液在40、50、60 ℃條件下分別處理0、2、4、6 h和8 h，按標準酶活力測定方法測定各條件下殘余酶活力確定重組漆酶的溫度穩(wěn)定性。同時將純化的酶液置于緩沖液（pH 5、pH 7和pH 9）中，冰上放置0、2、4、6 h和8 h，按標準酶活力測定方法測定各條件下殘余酶活力確定pH值穩(wěn)定性。

1.3.5.3 化學(xué)試劑和不同金屬離子對酶活力的影響

將純化的酶液分別添加濃度均為10 mmol/L的金屬離子（K+、Na+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+）、SDS和體積分數(shù)10%有機試劑（甲醇、乙醇和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）），測定各條件下的漆酶活力。

樣品破碎和鋯石挑選由廊坊峰之源礦物分選技術(shù)服務(wù)公司完成。樣品經(jīng)破碎后，人工淘洗保留重砂部分。對重砂部分進行電磁分選和重液分選，得到一定純度的鋯石樣品，然后在雙目鏡下人工挑選出晶形完好、透明度高、無裂紋的鋯石晶體。制靶時，將待測樣品與標準樣品TEM同時放置。磨蝕和拋光樹脂靶，直至鋯石核心部位暴露再進行陰極發(fā)光顯微照相，陰極發(fā)光圖像在中國地質(zhì)科學(xué)院礦產(chǎn)資源研究所電子探針實驗室拍攝，并結(jié)合透射光和反射光圖像觀察鋯石內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.3.5.4 Km和Vmax測定

選用不同濃度的ABTS（1、2、3、4、5 mol/L）緩沖液作底物，在最適溫度和最適pH值緩沖液條件下測定酶活力，使用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km及Vmax值[16]。

1.3.6 重組漆酶降解AFM1能力的測定

配制AFM1質(zhì)量濃度為400 μg/L的牛奶，加入1 U/mg的CotA漆酶，分別在37 ℃、中性條件下反應(yīng)24、48、72 h，參照說明書使用AFM1酶聯(lián)免疫試劑盒測定AFM1的殘留含量，實驗進行3 次測定，取平均值。降解率計算如式（2）所示：

式中：A為AFM1初始質(zhì)量濃度；B為反應(yīng)后AFM1的質(zhì)量濃度。

1.3.7 降解產(chǎn)物的毒性分析

質(zhì)量濃度400 μg/L的AFM1溶液加入1 U/mg的CotA漆酶，分別在37 ℃條件下反應(yīng)24、48 h和72 h，作為樣品組保存在－20 ℃處待測，以不含AFM1的CotA漆酶和質(zhì)量濃度400 μg/L的AFM1溶液作為空白對照和陽性對照。將樣品解凍后加入到10 mL終止液中（甲醇-水體積比30∶70），加入5 mL氯仿，冰水浴超聲萃取15 min，使用分液漏斗收集下層氯仿，重復(fù)3 次[17]。將收集所得的氯仿蒸干，使用1640培養(yǎng)液復(fù)溶，制成不同時間的降解產(chǎn)物培養(yǎng)液。

使用加入10%小牛血清的1640培養(yǎng)液與SMMC-7721肝癌細胞混勻，將混勻液轉(zhuǎn)到細胞培養(yǎng)瓶中，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)。當(dāng)SMMC-7721細胞數(shù)量達到4×108個/mL，取100 μL細胞培養(yǎng)物和100 μL不同時間的降解產(chǎn)物培養(yǎng)液加入96 孔板中，將96 孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中48 h，在終止培養(yǎng)前4 h，各孔添加5 mg/mL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）10 μL，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入90 μL甲瓚溶解劑（14% SDS+50% N,N-二甲基甲酰胺）培養(yǎng)過夜，混勻后測其570 nm處的吸光度[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

每次實驗平行測定3 次，利用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

使用cotA-PF、cotA-PR為引物，以B. pumilus E-1-1-1的基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到的特異性條帶與pEASY-T1載體連接構(gòu)建pEASY-T1-cotA質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細胞后對陽性克隆子進行測序。分析測序結(jié)果得到B. pumilus E-1-1-1來源的cotA基因長度為1 486 bp，編碼495 個氨基酸，不含信號肽，相對分子質(zhì)量約58 kDa，理論等電點為5.94。使用Clustal軟件將翻譯后的氨基酸序列（E-1-1-1 CotA）與細菌漆酶的氨基酸序列進行多序列比對，結(jié)果顯示與B. pumilus序列AFV60743.2O同源性最高，為96%；與紅毛栓菌AAB47735.2同源性為46%。將cotA漆酶基因與5 個細菌漆酶和1 個真菌漆酶序列進行比對，保守氨基酸殘基如圖1所示。細菌漆酶蛋白與4 個Cu2+結(jié)合位點的12 個氨基酸非常保守，這些高度相似的氨基酸殘基構(gòu)成細菌漆酶中4 個相對保守的氨基酸序列。

圖1 漆酶氨基酸序列比對Fig. 1 Alignment of laccase amino acid sequences

2.2 CotA漆酶的表達及純化

圖2 重組CotA漆酶SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant CotA laccase

對質(zhì)粒pEASY-T1-cotA和pET-30a（+）進行雙酶切，使用T4 DNA連接酶連接雙酶切產(chǎn)物，熱激轉(zhuǎn)化E. coli（DE3），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-cotA，陽性克隆經(jīng)測序后，結(jié)果正確。用構(gòu)建好的pET-30a-cotA重組表達載體，在E. coli（DE3）中采用低溫誘導(dǎo)法進行表達活力達到367 U/L。同時，蛋白抽提試劑盒得到的可溶性蛋白經(jīng)親和層析純化，收集不同濃度的洗脫液，經(jīng)SDSPAGE檢測，在58 kDa處出現(xiàn)目的蛋白條帶（圖2）。

2.3 CotA漆酶酶學(xué)性質(zhì)的表征

圖3 溫度和pH值對重組CotA漆酶活力的影響Fig. 3 Effects of temperature and pH on the activity of recombinant CotA laccase

由圖3A、B可知，CotA漆酶最適溫度為40 ℃，在40～60 ℃溫度范圍內(nèi)，酶的相對活性可達70%以上。然而，超出60 ℃以后CotA漆酶活力急劇下降，表明重組漆酶在高溫下快速變性，70 ℃時剩余活力為34.1%，80 ℃時完全消失。漆酶的最適反應(yīng)溫度一般較高（40～70 ℃），如密孔菌L3漆酶最適反應(yīng)溫度為55～75 ℃[20]；云芝漆酶最適反應(yīng)溫度為85 ℃[20]。在40 ℃條件下漆酶CotA漆酶的活性很穩(wěn)定8 h內(nèi)無明顯變化，但隨著溫度升高至60 ℃，6 h后CotA漆酶的剩余活力為48%。離開了孢子結(jié)構(gòu)，漆酶經(jīng)重組表達后的穩(wěn)定性降低，如枯草芽孢桿菌WD23漆酶接近溫度范圍（40～90 ℃）在pH 7.0時高度穩(wěn)定，經(jīng)重組表達后熱穩(wěn)定性出現(xiàn)明顯降低[21]。

由圖3C、D可知，在pH 4時酶活力最高。另外，pH值在4～8范圍內(nèi)具有明顯的活性，其活性均保持在50%以上，但是超出此范圍后酶的漆酶活力均大幅降低。根據(jù)已報道的研究，CotA漆酶是一種酸性酶，最適pH值大多在酸性范圍內(nèi)，B. pumilusW3CotA、B. pumilusDSM 27漆酶的最適pH值為4.5[22-23]，在此pH值范圍內(nèi)的其他細菌漆酶也表現(xiàn)出較高的活力；大部分真菌漆酶最適pH值為2～5，少部分最適pH值為中性[24]。經(jīng)過重組后的漆酶在中性和酸性條件下表現(xiàn)出良好的耐受性半衰期均大于8 h，在pH值為9的條件下其半衰期為8 h。大部分漆酶在中性和中性偏堿的條件（pH 6～10）能夠穩(wěn)定保存[25]。結(jié)果表明細菌CotA漆酶比真菌漆酶有更好的酸堿適用性。

表1 金屬離子和有機試劑對CotA漆酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions and organic reagents on recombinant CotA laccase activity

由表1可知，SDS、K+、Na+、Ca2+、乙醇和甲醇都會降低CotA漆酶活力；Cu2+、Mn2+、Zn2+、DMSO可以提高CotA漆酶活力。其中SDS對CotA漆酶活力抑制最強，10 mol/L下活力降低了95.7%；Mn2+對CotA漆酶活力提高最多，10 mol/L下活性提高33.0%。在細菌來源的漆酶中加入Na+會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而影響其活性，CotA漆酶受Na+的影響較小下降了13.6%，在某些嗜鹽細菌中獲得的漆酶也表現(xiàn)出相似的性質(zhì)[26]。高濃度有機試劑抑制了CotA漆酶活力，在10%甲醇和乙醇溶液中保持了35.5%和67.2%的相對活力，在10% DMSO溶液中活力則有所上升。CotA漆酶活力隨著10 mmol/L CuSO4的添加而達到125.3%。Cu2+的加入一般會使漆酶活力出現(xiàn)大幅度的提升[27]，由于本實驗最終將應(yīng)用放在食品工業(yè)上，所以不會額外添加Cu2+增加CotA漆酶活力，因為這樣會提高Cu2+二次污染的風(fēng)險。

動力學(xué)曲線回歸方程為y=3.794x+1.257 6，R2＝0.993 5，該曲線擬合良好，可以作為反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)計算的方程模型。由回歸方程可計算得：Km為3.01 mmol/L，Vmax為0.795 mmol/（L·min）。

2.4 CotA漆酶降解AFM1能力

圖4 時間對CotA漆酶降解AAFM1的影響Fig. 4 Effect of contact time on CotA degradation of AFM1

如圖4所示，將人工污染牛奶與CotA漆酶37 ℃貯存72 h后，AFM1的降解率為54.3%。以72 h作為降解AFM1的終點，是由于在已報道的生物降解黃曲霉毒素研究中降解終點的時間設(shè)置上有很大不同，但細菌降解時間3 d（28～37 ℃），真菌降解時間7 d（25～30 ℃）為較普遍條件[28]。本實驗所得出CotA漆酶的AFM1降解率與AFB1降解率（降解率為74%）相比有較大差異，可能是由于AFM1與AFB1結(jié)構(gòu)不同，也有可能是由于牛奶中豐富的蛋白質(zhì)含量干擾了CotA漆酶對AFM1的脫除。Guimar?es等[29]發(fā)現(xiàn)乳酸菌的加入對牛奶中的AFM1含量沒有影響，推測在牛奶中乳酸菌脫除AFM1的能力可能會受到提取程序、毒素濃度、分析時間、貯存溫度等多方面的影響；有結(jié)果表明，pH值的降低與相應(yīng)黃曲霉毒素含量的下降呈正比關(guān)系，pH值降低越多，漆酶活力越強，黃曲霉毒素的含量下降越大。從降解效果上看，CotA漆酶可以作為一種AFM1生物脫毒手段應(yīng)用到牛奶脫毒中。

2.5 不同時間降解產(chǎn)物的毒性分析

通過M T T法，得到A F M1對人肝癌細胞株SMMC-7721的存活率影響，1 μg/mL AFM1對SMMC-7721細胞的殺傷率最高，存活率為32.87%；0～100 ng/mL AFM1對SMMC-7721細胞影響不大。以不同質(zhì)量濃度下AFM1對應(yīng)的SMMC-7721細胞存活率進行回歸計算，得到對細胞產(chǎn)生抑制的IC15為400 μg/L。

圖5 AFM1經(jīng)CotA漆酶脫毒后對SMMC-7721細胞存活率的影響Fig. 5 Effect of AFM1 detoxi fication by CotA laccase on the survival rate of SMMC-7721 cells

將不同時間下AFM1的降解產(chǎn)物與SMMC-7721肝癌細胞混合，如圖5所示，使用CotA漆酶處理24 h后細胞存活率由AFM1對照組的81.5%上升到87.0%，72 h后上升到93.6%。AFM1細胞毒性的主導(dǎo)機制是DNA氧化損傷，其相互作用取決于細胞接觸的AFM1濃度，在較高質(zhì)量濃度下，AFM1由于其親脂結(jié)構(gòu)很容易被結(jié)合到細胞膜上，并以協(xié)同的方式發(fā)揮其細胞毒性[30]。在CotA漆酶作用下AFM1對肝癌細胞的毒性減小說明AFM1濃度降低，同時證明CotA漆酶能夠有效脫除AFM1。

3 結(jié) 論

對黃曲毒素解毒cotA基因進行異源表達，繼而獲得高活性的黃曲毒素降解酶，是生物法降解黃曲霉毒素的重要研究方向。本研究從B. pumilus E-1-1-1中克隆得到總長為1 486 bp的cotA漆酶基因，并使用大腸桿菌成功表達，純化獲得的CotA漆酶蛋白最適溫度為40 ℃，最適pH值為4，60 ℃半衰期為6 h，pH 9條件下半衰期為8 h，對有機溶劑和NaCl具有相當(dāng)大的耐受性。CotA漆酶對牛奶中的AFM1有很強的降解效果，降解率達54.3%，降解產(chǎn)物毒性顯著降低。實驗結(jié)果證明生物酶CotA可以有效降解AFM1并且不會產(chǎn)生其他有毒物質(zhì)。目前，CotA漆酶還需要繼續(xù)進行基因優(yōu)化，進一步提升該酶的應(yīng)用潛力。