顏阿娜，陳聲漾，陳 旭，田永奇，付才力，汪少蕓*

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

氧化在人體生命運轉(zhuǎn)和食品加工貯藏中是一個由自由基介導(dǎo)的過程，對生物個體和食品都產(chǎn)生不利的影響[1]。當(dāng)人體受到外界刺激時，產(chǎn)生過多的自由基，對細胞保護酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶）造成傷害，甚至損傷細胞，如氧化細胞蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)以及損傷DNA/RNA等[2-3]，進而引發(fā)機體或組織衰老[4-5]、癌癥[6]和帕森斯綜合癥[7]等多種疾病。此外，在食品加工生產(chǎn)和貯藏過程中，食品營養(yǎng)成分氧化，不僅會引起食品品質(zhì)下降，還有可能導(dǎo)致食品攝入者發(fā)生疾病[8-9]。因此，抗氧化劑在食品領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。但常用的人工合成抗氧化劑往往會對人體產(chǎn)生不利的影響，具有一定的毒性和致癌作用，有些國家已經(jīng)禁止在食品中添加合成抗氧化劑。因此，尋找安全性的抗氧化劑至關(guān)重要?？寡趸嚯氖且环N同時具備抗氧化和生物安全性高的肽類物質(zhì)，是生物抗氧化劑的較好來源。海洋生物由于其特殊的生活環(huán)境，在適應(yīng)環(huán)境的進化過程中，形成了獨特的遺傳代謝機制和防御機制，是目前獲得抗氧化活性物質(zhì)的主要來源之一[10]。目前已從海洋生物如牡蠣、蝦、魷魚、紫貽貝以及其他魚類中鑒定出具有抗氧化活性的多肽[11-14]。黑鯊，學(xué)名鐮狀真鯊（Carcharhinus falciformis），別稱五羊、絲鯊，屬于真鯊目，主要分布于熱帶和亞熱帶等海域。鯊魚皮粗蛋白含量高達87.5%，脂肪含量僅0.15%，具有“高蛋白低脂肪”的特點[15]。江勇[16]從鯊魚皮明膠水解物中分離純化出3 個抗氧化肽，但其抗氧化機理尚未闡明。事實上，在抗氧化肽的相關(guān)研究中，主要集中于通過現(xiàn)代分離純化手段，從蛋白水解物中分離得到抗氧化肽，并分析其氨基酸序列，雖有些涉及到抗氧化肽活性位點[17]、空間結(jié)構(gòu)[18-19]和一級結(jié)構(gòu)與功能[20]方面的研究，但其分子機制和抗氧化機理方面尚未徹底闡明。因此，本實驗以黑鯊魚皮為原料，采用蛋白酶水解制備抗氧化多肽，并進行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，從化學(xué)的角度探究純化肽清除自由基的作用機理和構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯊魚皮由福建福州宏東遠洋漁業(yè)有限公司提供。

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶 丹麥諾維信公司；乙腈、三氟乙酸、甲醇（均為色譜純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochlori，AAPH） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Gemini C18高效液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國Phenomenex公司；MALDI SYNAPT Q-TOF高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀 美國Waters公司；FD-3真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；SpectraMax i3x酶標儀 美谷分子公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 上海昂拉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑鯊魚皮前處理

將黑鯊魚皮殘余的魚肉和脂肪去除，洗凈，切成小塊，然后置于50 ℃干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，最后將烘干的黑鯊魚皮用粉碎機粉碎成60 目的粉末，密封保存。

1.3.2 黑鯊魚皮酶解工藝

魚皮→去脂肪、清洗、切塊→烘干→粉碎→加水→調(diào)節(jié)pH值→加酶水解→沸水滅酶15 min→離心→取上清液→冷凍干燥→凍干粉

1.3.3 抗氧化肽制備條件優(yōu)化

采用以DPPH自由基清除率為主要指標、水解度為輔助指標的雙指標檢測方法，通過實驗優(yōu)化，篩選出最佳酶解工藝條件。分別考察酶解工藝條件中蛋白酶（中性蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）、pH值（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、酶添加量（97、162、226、291、356 U/mL）、酶解時間（2、3、4、5、6 h）、底物質(zhì)量分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%）和酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對魚皮酶解工藝制備多肽的抗氧化活性和水解度的影響。表1是蛋白酶最適pH值和溫度，考察最佳蛋白酶酶解工藝條件為5 種蛋白酶所對應(yīng)的最適pH值和溫度。

表1 蛋白酶最適pH值和溫度Table 1 Optimum temperature and pH for proteases

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在前期單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定底物質(zhì)量分數(shù)為3%，酶解溫度為45 ℃。以pH值（A）、酶解時間（B）、酶添加量（C）為自變量，以水解度和DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計3因素3水平試驗，試驗設(shè)計如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Code and level of independent variables used for Box-Behnken dessiiggnn

1.3.5 抗氧化肽的分離純化及鑒定

1.3.5.1 抗氧化肽的分離純化

取適量黑鯊魚皮蛋白肽凍干粉溶于去離子水，12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾去雜質(zhì)。樣品進樣量為100 μL，檢測波長為214 nm，流速為4.0 mL/min；流動相A液為含0.05%三氟乙酸溶液，B液為0.05%三氟乙酸-乙腈溶液，以乙腈體積分數(shù)為0%～40%的梯度洗脫；分別收集各組分，并測定其抗氧化活性，收集具有較高抗氧化活性的組分，凍干并在－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 新型抗氧化五肽的鑒定

通過反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離得到抗氧化活性最高的組分，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行氨基酸序列鑒定。色譜條件：流動相：0.1%乙酸的乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；檢測波長：214 nm；色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm）。質(zhì)譜條件：正離子檢測方式；母離子掃描范圍m/z50～2 000；碰撞能量6 eV。所得的質(zhì)譜經(jīng)MaxEnt3和PepSeq軟件分析鑒定，得到抗氧化肽氨基酸序列。

1.3.6 新型抗氧化五肽的合成

通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的抗氧化肽，委托廈門博欣生物技術(shù)有限公司合成，純度達到98%以上，后續(xù)實驗所用到的抗氧化肽均為合成肽。

1.3.7 水解度的測定

酶解液水解度的測定參照甲醛滴定法[21]。1.3.8 體外抗氧化活性測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力

參照Wu Huichun等[22]的方法測定，略有改動。取不同質(zhì)量濃度樣品1 mL與DPPH溶液（0.1 mmol/L，95%乙醇溶液配制）1 mL充分混勻，室溫避光靜置30 min，517 nm波長處測定吸光度；用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液為樣品參比組；空白組為1 mL DPPH溶液與1 mL 95%乙醇溶液。樣品的DPPH自由基清除率根據(jù)式（1）進行計算：

式中：Ai為樣品組吸光度；Aj為樣品參比組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.8.2 氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）

參照You Juan等[23]的方法并稍加改進，采用96 孔板熒光測定。20 μL樣品與80 μL磷酸鹽緩沖液（75 mmol/L）以及50 μL熒光素FL溶液（200 nmol/L）混合，37 ℃恒溫箱中避光保溫15 min，反應(yīng)結(jié)束后加入50 μL AAPH溶液（80 mmol/L），立即放置酶標儀讀取熒光值。酶標儀設(shè)置激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為538 nm，每隔1 min讀取熒光值，連續(xù)測定，共進行90 min。磷酸鹽緩沖液代替樣品作為空白對照。

ORAC值以Trolox當(dāng)量（μmol/g）表示，使用濃度分別為0.94、1.9、3.8、7.5、15、30、60 μmol/L，繪制熒光猝滅曲線，并計算其積分面積（AUC）如式（2）所示，ORAC值用樣品曲線斜率與Trolox曲線斜率之比表示。

式中：f0為0 min時熒光吸光度；fi為imin時熒光吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化肽制備條件優(yōu)化

不同蛋白酶的酶切位點不同，同種蛋白底物與不同蛋白酶反應(yīng)，其作用結(jié)果也不同[24]。5 種蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度和DPPH自由基清除率有所差異（圖1A），其中復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度最大，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物次之，酸性蛋白酶最弱，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物DPPH自由基清除活性最強，酸性蛋白酶水解產(chǎn)物次之。以抗氧化活性為主要指標，水解度為輔助指標，綜合考慮，最終確定堿性蛋白酶為制備黑鯊魚皮抗氧化肽的最佳用酶。隨著酶添加量的增加，酶解產(chǎn)物的水解度和DPPH自由基清除活性增大（圖1B），當(dāng)酶添加量大于291 U/mL時，DPPH自由基清除率增長趨勢開始減緩，這可能是因為酶和底物的比例接近酶結(jié)合的最佳狀態(tài)。因此，選擇酶添加量為291 U/mL。

圖1 酶種類（A）和酶添加量（B）對產(chǎn)物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 1 Effect of enzyme type (A) and dosage (B) on degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity

蛋白酶對pH值環(huán)境有選擇性，偏離最適pH值，其活性下降，相應(yīng)的水解度和抗氧化活性也會受到影響；當(dāng)pH值為8.0時，水解度最大，當(dāng)pH值大于8.5，酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化活性均下降（圖2A）；pH值會影響底物的解離狀態(tài)，從而影響水解情況及抗氧化活性[25]，因此，選擇酶解pH值為8.5。酶解時間大于5 h，水解度和DPPH自由基清除率上升緩慢（圖2B）；這可能是因為在水解后期，蛋白酶作用的底物減少，酶切位點減少，酶對底物的作用基本結(jié)束[26]，因此，酶解時間選5 h為宜。

圖2 pH值（A）和酶解時間（B）對產(chǎn)物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 2 Effects of pH (A) and hydrolysis time (B) on degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity

底物質(zhì)量分數(shù)大于3%，水解度增加不明顯，底物質(zhì)量分數(shù)大于4%時，DPPH自由基清除率出現(xiàn)下降趨勢（圖3A）；這可能是因為底物質(zhì)量分數(shù)過高，反應(yīng)體系黏度大，酶分布不均，底物不能完全酶解[27]，因此，確定底物質(zhì)量分數(shù)3%為最佳反應(yīng)條件。堿性蛋白酶在45 ℃的酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出最佳水解度和DPPH自由基清除率（圖3B）。因此，最終確認黑鯊魚皮蛋白水解條件為：選擇堿性蛋白酶、pH 8.5、酶添加量291 U/mL、底物質(zhì)量分數(shù)3%，酶解溫度45 ℃、酶解時間5 h。在此條件下，所得的抗氧化肽DPPH自由基清除率IC50為3.19 mg/mL。

圖3 底物質(zhì)量分數(shù)（A）和酶解溫度（B）對產(chǎn)物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig. 3 Effects of substrate concentration (A) and temperature (B) on degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging capacity

2.2 回歸方差及交互作用分析

以DPPH自由基清除率為主要指標（Y1），以水解度為輔助指標（Y2），通過響應(yīng)面分析，考察pH值、酶解時間和酶添加量對黑鯊魚皮酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率和水解度的影響，將試驗產(chǎn)生的結(jié)果用Design-Expert 8.0.6軟件模擬模型，得出二次回歸模型方程：

Y1=127.07－28.37A－1.09B+14.06C+1.92AB+0.52AC－0.33BC+0.65A2－1.17B2－0.72C2

Y2=103.80－17.50A－11.46B+1.68C+1.55AB－0.21AC－0.03BC+0.69A2－0.06B2+0.05C2

表3 模型回歸方程方差分析（DPPH自由基清除率為響應(yīng)值）Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of quadratic polynomial regression equation with DPPH radical scavenging capacity as response value

表4 模型回歸方程方差分析（水解度為響應(yīng)值）Table 4 ANOVA of quadratic polynomial regression equation with DH as response value

回歸方程的方差分析和顯著性檢驗結(jié)果見表3和表4。兩個模型的P值小于0.000 1，說明兩個模型極顯著，可用于鯊魚皮蛋白酶解效果的分析和預(yù)測。因素B、C、AB對水解度的影響高度顯著，因素A、C、C2對DPPH自由基清除率的影響高度顯著，因素AB、B2對DPPH自由基清除率的影響極顯著。表明pH值和酶解時間對水解度的主效應(yīng)明顯，并且兩者之間存在交互作用。

利用軟件對響應(yīng)面進行優(yōu)化分析，可得鯊魚皮最佳酶解工藝為酶解溫度45 ℃、底物質(zhì)量分數(shù)3%、pH 8.0、酶解時間4.9 h、酶添加量311 U/mL，重復(fù)5次實驗，測得水解度為（14.21±0.04）%，DPPH自由基清除率為（77.61±0.12）%，與預(yù)測值接近，從而確認了最佳酶解條件。

2.3 抗氧化肽的分離純化

將冷凍干燥的黑鯊魚皮酶解產(chǎn)物經(jīng)過RP-HPLC分離純化，結(jié)果如圖4所示。黑鯊魚皮酶解產(chǎn)物共洗脫出26個組分，分別測定其DPPH自由基清除率，如圖5所示，不同組分對DPPH自由基的清除率有所差異，其中F19組分的DPPH自由基清除率最大。因此，將活性最高的F19組分做下一步的分離鑒定。

圖4 黑鯊魚皮抗氧化肽分離RP-HPLC圖Fig. 4 RP-HPLC separation of antioxidant peptides derived from black shark skin

圖5 RP-HPLC分離黑鯊魚皮抗氧化肽各組分的DPPH自由基清除活性Fig. 5 DPPH radical scavenging activity of antioxidant peptides separated from black shark skin hydrolysate by RP-HPLC

2.4 抗氧化五肽的鑒定分析

圖6 一級質(zhì)譜的總離子流圖Fig. 6 Total ion current chromatogram for F19

將F19組分經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，其一級質(zhì)譜的總離子流圖即飛行時間質(zhì)譜做檢測器的色譜圖，如圖6所示。選擇抗氧化活性高的色譜峰（保留時間為10.02 min左右）進行一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜分析，以獲得純化的新型抗氧化肽分子。

圖7為抗氧化肽一級質(zhì)譜ESI-MS圖，m/z462為其分子離子峰[M+H]+的離子信號，m/z923為[2M+H]+的離子信號，因此可以計算出純化抗氧化肽的分子質(zhì)量為461 Da。

圖7 抗氧化肽一級質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectrum of F19

對一級質(zhì)譜中m/z462離子信號做二級質(zhì)譜分析，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果通過MaxEnt3和MasSeq軟件分析出肽段的序列信息，結(jié)果如圖8所示。經(jīng)鑒定，所分離純化的多肽為一種新型抗氧化五肽，其氨基酸序列為Pro-Gly-Gly-Thr-Met（PGGTM）。

圖8 抗氧化肽的二級質(zhì)譜圖Fig. 8 MS/MS spectrum of F19

2.5 抗氧化五肽的活性表征及可能作用機理

表5 Pro-Gly-Gly-Thr-Met的抗氧化活性Table 5 Antioxidant activity of Pro-Gly-Gly-Thr-Met in comparison to BHT

純化五肽Pro-Gly-Gly-Thr-Met的抗氧化活性如表5所示，Pro-Gly-Gly-Thr-Met的DPPH自由基清除率為75.01%（肽質(zhì)量濃度1.0 mg/mL），ORAC值為2 490.01 μmol/g。因此，Pro-Gly-Gly-Thr-Met具有抗氧化活性。

純化五肽Pro-Gly-Gly-Thr-Met中，Pro是膠原蛋白特有的氨基酸，有文獻表明Pro在肽類抗氧化活性中起到重要的作用[10]，其清除自由基過程可能為環(huán)類氨基酸Pro提供質(zhì)子給自由基，并且兩個帶有自由基的Pro能夠自身反應(yīng)，阻止了自由基鏈式傳遞[28-29]（圖9）。疏水性氨基酸如Met能增強多肽的抗氧化活性，Met被活性氧快速氧化成甲硫氨酸亞砜，消耗周圍的氧，起到抗氧化作用[30]。因此，Pro-Gly-Gly-Thr-Met具有抗氧化作用，其中N端的Pro和C端的Met可能起到關(guān)鍵性作用。

圖9 Pro-Gly-Gly-Thr-Met清除DPPH自由基機理圖Fig. 9 Schematic illustration of the reaction mechanism between Pro-Gly-Gly-Thr-Met and DPPH radical

3 結(jié) 論

以DPPH自由基清除率為主要指標，以水解度為輔助指標，采用單因素試驗優(yōu)化制備黑鯊魚皮抗氧化肽，得到最優(yōu)的制備條件為：堿性蛋白酶在pH 8.0、酶添加量311 U/mL、底物質(zhì)量分數(shù)3%條件下，于45 ℃恒溫搖床反應(yīng)4.9 h。獲得純化的新型抗氧化分子Pro-Gly-Gly-Thr-Met，其具有抗氧化活性，其中N端的Pro和C端的Met可能是抗氧化關(guān)鍵性作用位點。