束成杰，張孟麗，趙孔發(fā)，張鋒倫，張衛(wèi)明*

(1. 南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京211111；2. 南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210023；3. 昭通市大成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司, 云南 昭通657100)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)，常見的松樹寄生蟲，屬于線形動(dòng)物門，滑刃目(Aphelenchida)、滑刃科(Aphelenchoididae)、傘滑刃屬(Bursaphelenchus)動(dòng)物[1]。松材線蟲病又名松材線蟲萎蔫病、松樹萎蔫病、松樹枯萎病，是一種松樹毀滅性病害，具有危害性大、傳播速度快、防治難度大等特點(diǎn)，是世界性檢疫對(duì)象。松材線蟲的生活史如圖1所示，包括2個(gè)周期，分別是繁殖周期和擴(kuò)散周期，繁殖周期和擴(kuò)散周期同樣需經(jīng)歷卵、一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲、四齡幼蟲(即 L1，L2，L3，L4)和成蟲六個(gè)蟲態(tài)。在25 ℃左右的條件下，松材線蟲4～5 d即可繁殖一代[2-3]。與繁殖周期不同的是，擴(kuò)散型幼蟲以L3蟲態(tài)在寄主松樹內(nèi)休眠越冬，第二年春天，擴(kuò)散型 L3 幼蟲脫皮成長(zhǎng)為擴(kuò)散型 L4，L4 為持久型幼蟲，通過(guò)媒介傳播侵染健康松樹來(lái)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，成長(zhǎng)為成蟲進(jìn)而繁殖。

圖1 松材線蟲生活史[2]

近幾十年來(lái)，圍繞植物源物質(zhì)防治植物病原線蟲開展了廣泛研究，殺線蟲劑的開發(fā)應(yīng)用正從原來(lái)的高毒、高殘留向低毒、高效、低殘留的綠色環(huán)保農(nóng)藥方向發(fā)展。早期實(shí)驗(yàn)使用棉球?qū)嶒?yàn)法測(cè)定了31科61種陸地植物對(duì)松材線蟲的毒殺活性[4]。實(shí)驗(yàn)對(duì)駱駝篷等15科28種植物提取物對(duì)線蟲的控制作用研究表明：駱駝篷、黃文江魚藤、桃花心木的提取物均對(duì)線蟲有很強(qiáng)的觸殺活性，而且也能明顯的增加植株地上部高度、重量和根長(zhǎng)。白花曼陀羅葉提取物和三尖杉有同樣的抑制線蟲發(fā)育現(xiàn)象[5, 6]。

青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)為蕓香科花椒屬植物，含有豐富的揮發(fā)油、生物堿、酰胺類化合物等成分，主要生物活性具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗病毒、保護(hù)心血管、提高機(jī)體免疫力等作用，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和日化行業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力[7, 8]。本文探究青花椒水提物及精油對(duì)松材線蟲的防治作用，為生態(tài)環(huán)保型農(nóng)藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；特級(jí)青花椒，采購(gòu)于云南省昭通市魯?shù)榍嗷ń贩N植基地。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)；ZNHW-II型智能恒溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司)；所有試劑均采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青花椒水提物制備方法

取干燥青花椒果皮100 g，粉碎后過(guò)40目篩，按料液比1:10加入蒸餾水加熱煮沸，水提3 h，過(guò)濾除雜，再經(jīng)減壓濃縮、干燥，得水提物浸膏，蒸餾水稀釋，過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，青花椒水提物母液濃度為40 mg/mL，4 ℃冰箱貯存，備用[9]。

1.3.2 青花椒精油制備方法

取干燥青花椒果皮100 g，粉碎后過(guò)40目篩，置于蒸餾瓶中，按料液比1:10加入蒸餾水浸泡12 小時(shí)，水蒸氣蒸餾4 小時(shí)，收集精油部分，加等體積的乙醚萃取3次，蒸發(fā)乙醚，干燥器干燥，得透明油狀物即為青花椒精油[10, 11]。

1.3.3 松材線蟲培養(yǎng)方法

文獻(xiàn)已總結(jié)報(bào)道了松材線蟲的培養(yǎng)方法。根據(jù)松材線蟲生活史，采用 PDA 平板培養(yǎng)灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，待其鋪滿平板后接種松材線蟲，25 ℃恒溫培養(yǎng)4～5天，用無(wú)菌水沖洗PDA平板，可獲得四齡幼蟲(L4)/成蟲。用蒸餾水收集線蟲并制備線蟲懸浮液(約100條/100 μL水溶液)。PDA 培養(yǎng)基制備及真菌培養(yǎng)按常規(guī)方法進(jìn)行[12-14]。

1.3.4 青花椒水提物殺蟲濃度探究

取青花椒母液，用無(wú)菌蒸餾水稀釋成20 mg/mL備用，96孔板中兩倍梯度稀釋，每孔再分別加入100 μL四齡幼蟲(L4)/成蟲懸浮液，最終濃度為2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039, 0.019 mg/mL，設(shè)三個(gè)平行，分別在4小時(shí)和24小時(shí)觀察一次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次[15]。

1.3.5 青花椒精油殺蟲濃度探究

取青花椒精油，用二甲亞砜(DMSO)溶解，再用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行稀釋，96孔板中分別加入100μL不同濃度的青花椒精油，再各加入100 μL四齡幼蟲(L4)/成蟲懸浮液，1% DMSO溶液為空白對(duì)照。青花椒精油濃度梯度(v/v)為0.8%, 0.4%, 0.2%, 0.1%, 0.05%,0.025%, 0.012%, 0.006%(二甲亞砜工作濃度低于1%)，設(shè)三個(gè)平行，分別在4小時(shí)和24小時(shí)觀察一次，記錄L4/成蟲的死亡率。松材線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)在立體顯微鏡下用鉑金絲對(duì)線蟲進(jìn)行物理刺激后，身體仍然保持靜止不動(dòng)的線蟲即判定為死亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次[16-17]。

1.3.6 青花椒水提物對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

松材線蟲在液體中圍繞身體的中點(diǎn)的有規(guī)律的彎曲，被稱為“擺動(dòng)”[18]。在96孔板中，將L4/成蟲用青花椒水提物的梯度濃度處理4小時(shí)和 24小時(shí)。通過(guò)倒置顯微鏡目測(cè)觀察和手持式計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，確定 1 min內(nèi)的線蟲頭部的擺動(dòng)次數(shù)，每組數(shù)量不低于30條，設(shè)三個(gè)平行，分別在4小時(shí)和24小時(shí)觀察一次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次[6]。

1.3.7 青花椒精油對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

在96孔板中，將 L4/成蟲用青花椒精油的梯度濃度處理4小時(shí)和 24小時(shí)，同時(shí)設(shè)置1% DMSO溶液為對(duì)照。通過(guò)倒置顯微鏡目測(cè)觀察和手持式計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，確定 1 min內(nèi)的線蟲頭部的擺動(dòng)次數(shù)，每組數(shù)量不低于30條，設(shè)三個(gè)平行，分別在4小時(shí)和24小時(shí)觀察一次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖用Microsoft Excel 2017軟件繪制(Microsoft Corp., Redmond, WA)。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 12.0軟件完成(SPSS Inc., Chicage, USA)。不同的組別之間使用方差分析(ANOVA)。概率水平0.01代表統(tǒng)計(jì)分析上的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花椒水提物對(duì)松材線蟲的防治效果

按照上述實(shí)驗(yàn)方法，將松材線蟲暴露在不同濃度的青花椒水提物中。4小時(shí)和24小時(shí)分別觀察一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 4小時(shí)和24小時(shí)青花椒水提物處理松材線蟲致死率

處理4小時(shí)后，除0.019 mg/mL以外，各濃度對(duì)松材線蟲均具有顯著性的致死作用(**P<0.01)。濃度為0.625 mg/mL時(shí)，松材線蟲死亡率為(54.33%±2.52)%；濃度為2.5 mg/mL時(shí)，松材線蟲死亡率為100%。處理時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)后，松材線蟲死亡率上升，所有實(shí)驗(yàn)濃度對(duì)松材線蟲均具有顯著性地殺滅作用(**P<0.01)。當(dāng)濃度為0.313 mg/mL時(shí)，松材線蟲死亡率為(54.00%±2.65)%，濃度為1.25 mg/mL時(shí)，松材線蟲死亡率為100%。4小時(shí)和24小時(shí)殺蟲效果相比，由于時(shí)間的延長(zhǎng)，青花椒水提物殺蟲作用更加明顯。然而，在實(shí)際農(nóng)林生產(chǎn)應(yīng)用中，病蟲害防治需要考慮天氣因素，見效快也十分必要。因此，選擇處理4小時(shí)的0.625 mg/mL作為青花椒水提物防治松材線蟲的LC50，絕對(duì)致死劑量(LD100)為2.5 mg/mL。

2.2 青花椒精油對(duì)松材線蟲的防治效果

按照上述實(shí)驗(yàn)方法，將松材線蟲暴露在不同濃度的青花椒精油中。4小時(shí)和24小時(shí)分別觀察一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。處理時(shí)間為4小時(shí)，各濃度對(duì)松材線蟲均具有顯著性的致死作用(**P<0.01)。當(dāng)青花椒精油濃度為0.025%時(shí)，松材線蟲死亡率為55.67%±4.04%，濃度為0.2%和0.1% 時(shí)，松材線蟲死亡率為100%。處理24小時(shí)，殺蟲效果與4小時(shí)處理相比，殺蟲效果沒(méi)有顯著性的差異。因此，選擇處理4小時(shí)的0.025%作為青花椒精油防治松材線蟲的LC50，絕對(duì)致死劑量(LD100)為0.1%。

圖3 4小時(shí)和24小時(shí)青花椒精油處理松材線蟲致死率

2.3 青花椒水提物對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

運(yùn)動(dòng)行為反映了神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，并且依賴于多種因素包括外部刺激、神經(jīng)元結(jié)和動(dòng)物內(nèi)部環(huán)境的變化等。細(xì)胞或者功能水平上發(fā)生的變化可以深刻地影響線蟲基本的和誘發(fā)性的運(yùn)動(dòng)行為。因此，行為分析可為神經(jīng)元功能的檢測(cè)提供簡(jiǎn)單、敏感的方法。實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了4小時(shí)和24小時(shí)松材線蟲在青花椒水提物0.156、0.078、0.039、0.019 mg/mL濃度下1 min內(nèi)頭部擺動(dòng)的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青花椒水提物處理4小時(shí)后，除了0.019 mg/mL濃度下松材線蟲頭部擺動(dòng)未出現(xiàn)顯著性變化，其他處理濃度下松材線蟲頭部擺動(dòng)頻率與對(duì)照相比均出現(xiàn)顯著性降低(**P<0.01)(圖4)，線蟲蟲體表現(xiàn)出異常扭曲情況，主要是螺旋卷曲或多重卷曲，甚至僵直不動(dòng)。處理時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)，四個(gè)濃度下松材線蟲頭部擺動(dòng)頻率與對(duì)照相比均出現(xiàn)顯著性降低(**P<0.01)。綜上所述，青花椒水提物能夠改變松材線蟲的運(yùn)動(dòng)行為，從而影響松材線蟲的神經(jīng)功能。

圖4 處理4小時(shí)和24小時(shí)青花椒水提物對(duì)松材線蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響

2.4 青花椒精油對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了4小時(shí)和24小時(shí)松材線蟲在青花椒精油0.025%、0.012% 和0.006% 濃度下1 min內(nèi)松材線蟲頭部擺動(dòng)的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理4小時(shí)和24小時(shí)后，0.025%、0.012%、0.006% 三個(gè)濃度的青花椒精油均能顯著性地降低松材線蟲頭部擺動(dòng)頻率(**P<0.01)(圖5)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，24小時(shí)的處理結(jié)果也顯著性低于處理4小時(shí)的結(jié)果。綜上所述，青花椒精油能夠改變松材線蟲的運(yùn)動(dòng)行為，從而影響松材線蟲的神經(jīng)功能。

圖5 處理4小時(shí)和24小時(shí)青花椒精油對(duì)松材線蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響

3 討 論

青花椒作為花椒屬植物，廣泛種植于我國(guó)山西、四川、云南等地，研究顯示花椒主要有揮發(fā)油、生物堿等多種化學(xué)成分，對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫機(jī)能都有重要的作用[19-20]。松材線蟲是一種世界范圍內(nèi)的檢疫性害蟲，是松樹枯萎病的病原，它給木材以及木制品輸出國(guó)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[21-22]。本實(shí)驗(yàn)采用青花椒水提物及精油處理松材線蟲，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青花椒水提物及精油對(duì)松材線蟲均具有顯著的防治作用。 0.625 mg/mL青花椒水提物處理4小時(shí)，松材線蟲可達(dá)到半數(shù)致死，2.5 mg/mL則為絕對(duì)致死劑量(LD100)。0.025%青花椒精油處理4小時(shí)，松材線蟲可達(dá)到半數(shù)致死，0.1%則為絕對(duì)致死劑量(LD100)。

線蟲運(yùn)動(dòng)行為反映了其神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)行為的探究結(jié)果顯示，青花椒水提物0.156、0.078、0.039 mg/mL處理4小時(shí)，其頭部擺動(dòng)頻率均出現(xiàn)顯著性降低。青花椒精油0.025%、0.012%、0.006%三個(gè)濃度處理4小時(shí)，均能顯著性地降低松材線蟲頭部擺動(dòng)頻率，從而影響松材線蟲的神經(jīng)功能與活動(dòng)。

已有研究表明，植物源殺線蟲劑具有分解快、殘留低、污染少、毒性小等特點(diǎn)，如α-律草烯、松脂酚、苦豆堿等，其他植物提取物如毛魚藤根提取物、神農(nóng)香菊提取物、苦楝樹皮提取物等也對(duì)松材線蟲具有顯著性的殺滅作用[23, 24]。青花椒水提物和青花椒精油提取工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)量大，在粗提物的水平上即可用來(lái)防治松材線蟲，為生態(tài)環(huán)保型農(nóng)藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。我國(guó)花椒屬植物資源頗為豐富，對(duì)青花椒水提物及精油防治松材線蟲的研究，可提高青花椒的利用價(jià)值，為青花椒開發(fā)利用帶來(lái)新的特色。