陳玉慧，郭彤彤，張 鑫*，鄭曉杰

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波315211；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 溫州325000)

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinsk]是我國(guó)特有的胡桃科、青錢柳屬植物。青錢柳富含黃酮、三萜類物質(zhì)，具有清熱解暑、降血糖、降血脂、抗疲勞等多種功效，在我國(guó)作茶已有上千年歷史[1-3]。黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，具有各種結(jié)構(gòu)及生理活性。青錢柳中的黃酮類物質(zhì)主要包括山奈酚、槲皮素和異槲皮素[4]。而青錢柳中的三萜類物質(zhì)包括青錢柳獨(dú)有的青錢柳酸A、青錢柳酸B、青錢柳甙I、青錢柳甙II、青錢柳甙III及阿江橄欖酸、烏江酸、齊墩果酸、乳香酸等[5]。青錢柳中的天然黃酮及三萜類化合物，因其多種藥理活性而成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

在人體結(jié)腸中，微生物發(fā)揮著影響宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲取和能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵作用[6]。腸道微生物可分為有益細(xì)菌和有害細(xì)菌[7]，其中有益菌占總數(shù)的90%以上，主體是雙歧桿菌、乳酸桿菌等[8]。益生元是不易消化的食物成分，其可以通過(guò)刺激腸道中特定菌群的生長(zhǎng)，有效改善宿主腸道微生態(tài)[9]。雖然植物多酚在體外發(fā)揮了較好的生物活性，然而與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還缺乏一致性。在進(jìn)入人體腸道后，植物多酚被腸道菌群代謝成不同結(jié)構(gòu)和功能的衍生物，這些代謝衍生物可能是其在體內(nèi)真正發(fā)揮生物活性的有效成分。據(jù)報(bào)道，不同菌株的腸道細(xì)菌的增殖對(duì)于各種植物多酚及其代謝產(chǎn)物具有不同的敏感性[10]。在我們之前的研究中植物多酚展現(xiàn)了對(duì)腸道有益細(xì)菌的增殖作用[8,11]。然而關(guān)于青錢柳中多酚類物質(zhì)對(duì)于腸道菌群的影響，還鮮有報(bào)道。

本研究擬在實(shí)驗(yàn)室之前的工作基礎(chǔ)上，利用大孔樹(shù)脂分離純化青錢柳黃酮及三萜，并利用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)方式對(duì)于樣品進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)(FISH)分析厭氧發(fā)酵過(guò)程中雙歧桿菌、乳酸菌、擬桿菌、梭狀菌以及總菌群的數(shù)量變化，闡明其青錢柳黃酮及三萜對(duì)于人體腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用，為青錢柳資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳由浙江省文成縣泉山中藥材種植有限公司提供，去除雜質(zhì)和枝桿之后，粉碎過(guò)60目篩備用。聚酰胺及AB-8樹(shù)脂購(gòu)于青島海洋化工有限公司；低聚果糖購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；厭氧混合氣體(10% H2、10% CO2和80% N2)和高純N2購(gòu)于寧波甬興化工氣體有限公司；4,6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚二鹽酸(DAPI)熒光染料購(gòu)于德國(guó)Roche 公司；表1所示的FISH專用16S rRNA寡合苷酸單鏈探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成[8]。

表1 16S rRNA探針的靶細(xì)菌種/屬和探針序列

1.2 儀器與設(shè)備

Laborota 4000 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司；SHB-III型循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；冷凍干燥機(jī)，寧波新芝公司；AY-120 電子精密天平、BL-220H 分析天平，日本Shimadzu 公司；YQX-I厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Zeiss Axio ImagerA1 型熒光正置顯微鏡系統(tǒng)，德國(guó)Carl Zeiss 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青錢柳黃酮樣品的制備

稱取適量的粉碎青錢柳粉末，按照料液比1∶20加入熱水，在60 ℃恒溫振蕩器中振蕩提取40 min，4 500 ×g的條件下離心15 min得上清液，殘?jiān)猛瑯臃椒ㄔ俅谓?，合并兩次上清液并濃縮、凍干，得到青錢柳黃酮粗提物。

將青錢柳黃酮粗提物制成2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上聚酰胺層析柱(30 cm × 1.6 cm)。首先用水洗去水溶性雜質(zhì)，洗脫流速為2.0 mL/min，洗脫2 BV(BV為柱床體積)后，用80%的乙醇洗脫，采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液(10 mL/管)，濃縮、凍干，得到青錢柳黃酮樣品。

1.3.2 青錢柳黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用80%乙醇定容，配成濃度0.4 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、1.0 mL、1.2 mL分別置于10 mL試管中，分別加入50 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min后；加入10 mg/mL硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后用放置6 min后；加入40 mg/mL氫氧化鈉溶液4 mL，加水至刻度，混勻，放置15 min。用紫外分光光度計(jì)在509 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定吸光度，測(cè)定3次取平均值，以吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。稱取青錢柳黃酮樣品粉末溶于40%乙醇，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中所述測(cè)定方法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

1.3.3 青錢柳三萜樣品的制備

精確稱取干燥的青錢柳葉粉末0.5 g，用濾紙包好后至于索氏提取裝置中用石油醚脫脂脫色3 h(等體積脫脂2次)，揮干石油醚，以60%乙醇為提取劑提取，其中料液比為1:40，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為45 min，4 500 ×g的條件下離心10 min得上清液，同條件浸提2次，合并提取液，真空濃縮得到青錢柳三萜粗提物[5]。

將青錢柳三萜粗提物制成2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上AB-8層析柱(30 cm × 1.6 cm)。首先用水洗去水溶性雜質(zhì)，洗脫流速為2.0 mL/min，洗脫 2 BV(BV為柱床體積)后，用60%的乙醇洗脫，采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液(10 mL/管)，濃縮、凍干，得到青錢柳三萜樣品。

1.3.4 青錢柳三萜含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容，配成0.09 mg/mL的溶液，精確吸取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，分別加入具塞試管，水浴揮干溶劑。分別加入5% 香草醛-冰乙酸和高氯酸0.3 mL和1.0 mL，搖勻，70 ℃水浴15 min，然后迅速冷卻到常溫后加入4.0 mL冰乙酸，與550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以不加對(duì)照用品溶液而直接加入5% 香草醛-冰乙酸、高氯酸和冰乙酸的混合液作為空白對(duì)照，測(cè)定3次取平均值，以吸光度為橫坐標(biāo)，熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為縱坐標(biāo)，繪制熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取青錢柳三萜樣品粉末溶于甲醇，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中所述測(cè)定方法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中的三萜含量。

1.3.5 體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)

糞便樣本的收集與處理：收集受試者(受試者為5人，均為25～30歲之間健康人群，且在近兩個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)抗生素)的一次新鮮全便，置于一次性硬質(zhì)無(wú)菌塑料袋中。使用時(shí)混勻并稱取0.5 g，加入4.5 mL經(jīng)過(guò)濾、脫氧處理的PBS緩沖液，迅速置于厭氧培養(yǎng)箱中，經(jīng)旋渦混合器振蕩混勻3 min，待用。

體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行[8]。首先稱取受試的兒茶素樣品溶解于高壓滅菌后的含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，得到終質(zhì)量濃度為2 g/100 mL的底物溶液。然后取糞便樣液(10%、pH 7.3的PBS )150 μL懸浮于1.35 mL含有各種兒茶素樣品的底物培養(yǎng)基溶液中，混合均勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱(10% H2、10% CO2、80% N2)，37 ℃ 發(fā)酵培養(yǎng)。在培養(yǎng)時(shí)間為 0、6、12、24 h時(shí)分別取 100 μL 樣液，供細(xì)胞FISH計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照為不加任何青錢柳黃酮或三萜的樣品。

1.3.6 菌體計(jì)數(shù)

菌體計(jì)數(shù)采用FISH法[8]。將 300 μL 的多聚甲醛(4 g/100 mL、pH 7.2)加入到 100 μL體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)發(fā)酵樣液中，置于4 ℃冰箱中冷藏 16 h，離心后用PBS緩沖液沖洗兩次，再用300 μL PBS-酒精(1:1)保存菌體。取菌體樣液10 μL，滴入經(jīng)過(guò)鉻明膠溶液包埋過(guò)的載玻片圓孔內(nèi)，平鋪于整個(gè)圓圈，在陰暗處自然風(fēng)干3 h，然后用50%、80%、96%的乙醇溶液進(jìn)行連續(xù)脫水操作各3 min，自然風(fēng)干。將1 μL 50 ng/μL 的探針試劑與9 μL雜交緩沖液加到載玻片的菌體試樣中，然后迅速將載玻片置入含有雜交緩沖液的濕盒中，根據(jù)探針類型采用不同溫度條件(探針Bif164：50 ℃，探針Lab158：45 ℃，探針Bac303：45 ℃，探針Chis150：50 ℃)進(jìn)行雜交10 h。雜交結(jié)束后，迅速用清洗緩沖液與超純水沖洗載玻片，取出試樣載玻片，在避光條件下自然風(fēng)干。測(cè)定總菌體數(shù)時(shí)，將10 μL 1.25 ng/μL的DAPI溶液加入到雜交后的載玻片上，保持5 min，然后用超純水沖洗，自然干燥。所有樣品用Zeiss Axio Imager A1型熒光正置顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行觀測(cè)，采用AxioVision熒光成像軟件對(duì)每個(gè)試樣隨機(jī)選擇10-15個(gè)視野進(jìn)行拍照，記錄熒光光點(diǎn)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

在對(duì)雜交后的各種菌體進(jìn)行拍照與熒光光點(diǎn)計(jì)數(shù)后，根據(jù)試樣濃度以及稀釋倍數(shù)等計(jì)算出細(xì)菌總數(shù)，并取其以10為底的對(duì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳黃酮及三萜樣品的制備

青錢柳經(jīng)熱水浸提，濃縮和凍干，得到黃酮及三萜粗提物。由于粗提物中含有一定量茶多糖等雜質(zhì)，因此根據(jù)黃酮及三萜的特性，分別選取聚酰胺及AB-8樹(shù)脂，利用大孔樹(shù)脂層析柱對(duì)其進(jìn)行分離純化。經(jīng)過(guò)聚酰胺大孔樹(shù)脂柱層析分離之后，青錢柳中黃酮的含量提高到95%。同時(shí)，經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂柱層析分離之后，青錢柳三萜的含量提高到90%。

2.2 青錢柳黃酮及三萜對(duì)腸道中有益菌群(雙歧桿菌和乳酸菌)的增殖作用

表2為以青錢柳黃酮和三萜為底物時(shí)，不同發(fā)酵時(shí)間有益菌群(雙歧桿菌和乳酸菌)的增殖情況。由表2可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組中雙歧桿菌的數(shù)量逐漸增多。在每個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)，陽(yáng)性對(duì)照低聚果糖都具有最好的促進(jìn)雙歧桿菌增殖的效果，同時(shí)在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)，青錢柳黃酮和三萜樣品與對(duì)照組相比，都可以顯著促進(jìn)雙歧桿菌的增殖(P<0.05)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為6 h及12 h時(shí)，青錢柳黃酮和三萜同樣促進(jìn)了雙歧桿菌的增殖，但差異不顯著(P> 0.05)。而厭氧培養(yǎng)24 h時(shí)，青錢柳黃酮相對(duì)于三萜效果更好，可能是由于其不同的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，相應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

由表2中可以看出，在發(fā)酵時(shí)間分別為0、6、12與24 h時(shí)，乳酸菌數(shù)量在添加青錢柳黃酮和三萜的實(shí)驗(yàn)組中顯著增多，說(shuō)明樣品能積極促進(jìn)乳酸菌增殖。與對(duì)照組相比，在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)，青錢柳黃酮和三萜對(duì)乳酸菌的增殖作用也具有顯著差異(P< 0.05)，說(shuō)明其對(duì)乳酸菌也有較好的增殖效果。與對(duì)雙歧桿菌的影響類似，在厭氧培養(yǎng)24 h時(shí)，青錢柳黃酮相對(duì)于三萜發(fā)揮了更好的促進(jìn)乳酸菌增殖的效果。

表2 青錢柳黃酮和三萜體外厭氧發(fā)酵0、6、12、24 h后雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量 lg(CFU/mL)

注：同列不同小寫字母代表同一時(shí)間不同樣品之間對(duì)于該種菌屬有顯著性差異(P<0.05)；同行不同大寫字母代表同一樣品對(duì)于該種菌屬在不同發(fā)酵時(shí)間有顯著性差異(P<0.05)。下同。

2.3 青錢柳黃酮及三萜對(duì)腸道中擬桿菌和梭狀菌的增殖作用

表3為以青錢柳黃酮及三萜為底物時(shí)，不同發(fā)酵時(shí)間擬桿菌和梭狀菌的增殖情況。由表中可以看出，雖然每組擬桿菌的數(shù)量均隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，然而，相對(duì)于空白對(duì)照組，各組樣品均有效抑制了擬桿菌的增殖。在厭氧發(fā)酵超過(guò)6 h之后，陽(yáng)性對(duì)照組的低聚果糖在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯示了最為明顯的抑制增殖的效果。同時(shí)與對(duì)照組相比，青錢柳黃酮及三萜對(duì)擬桿菌的增殖均表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 h時(shí)，青錢柳黃酮及三萜抑制擬桿菌增殖的效果差異不顯著(P<0.05)，而發(fā)酵時(shí)間為12和24 h時(shí)，青錢柳黃酮相對(duì)于三萜，更為顯著抑制了擬桿菌的增殖(P<0.05)。

與擬桿菌類似，青錢柳黃酮及三萜同樣顯著抑制了梭狀菌的增殖。由表3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然各組擬桿菌的數(shù)量不斷增加，但與對(duì)照組相比，在不同的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)，青錢柳黃酮及三萜均顯著抑制了梭狀菌的增殖。而且值得注意的是，在發(fā)酵時(shí)間為12和24 h時(shí)，青錢柳黃酮相對(duì)于三萜，發(fā)揮了更好的抑制擬桿菌增殖的效果(P<0.05)。

表3 青錢柳黃酮和三萜體外厭氧發(fā)酵0、6、12、24 h后擬桿菌和梭狀菌的數(shù)量 lg(CFU/mL)

2.4 青錢柳黃酮和三萜對(duì)腸道總菌群數(shù)的影響

表4為以青錢柳黃酮和三萜為底物時(shí)，不同發(fā)酵時(shí)間腸道總菌群數(shù)的變化。由表中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，腸道總菌群數(shù)量在逐漸增多，在各組樣品中，不同發(fā)酵時(shí)間的腸道總菌群數(shù)，均具有差異顯著性(P<0.05)，同時(shí)各組樣品對(duì)腸道內(nèi)總菌群的影響差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明青錢柳黃酮和三萜基本不會(huì)影響腸道內(nèi)總菌群的數(shù)量。結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出，青錢柳黃酮和三萜只是改變了腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，而對(duì)總菌群數(shù)量無(wú)顯著影響。

表4 青錢柳黃酮和三萜體外厭氧發(fā)酵0、6、12、24 h后總菌群的數(shù)量 lg(CFU/mL)

3 結(jié) 論

人體消化道內(nèi)的正常微生物群大部分寄居于結(jié)腸內(nèi)，其數(shù)量達(dá)到1014個(gè)以上。雙歧桿菌的部分菌屬(Bifidobacteriumspp.)、乳酸菌/腸球菌的部分菌屬(Lactobacillus/Enterococcusspp.)是兩類對(duì)人體有益的微生物。此外，絕大多數(shù)的擬桿菌以及梭狀菌對(duì)維持腸道的生態(tài)平衡也具有重要作用，它們是在人體腸道內(nèi)長(zhǎng)期定植的菌群，但是其中某些種屬數(shù)量過(guò)多會(huì)破壞人體腸道內(nèi)菌群平衡，引發(fā)腹瀉、感染等疾病[8]。

益生元往往通過(guò)刺激人體腸道內(nèi)有益菌的生長(zhǎng)，如雙歧桿菌、乳酸菌等而對(duì)人體健康起到積極的作用[13]。膳食消費(fèi)不被人體消化的益生元，對(duì)于腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量的增殖具有促進(jìn)作用[14]。在目前研究中，低聚果糖對(duì)有益菌的生長(zhǎng)起到了最明顯的增殖作用，同時(shí)青錢柳黃酮和三萜對(duì)于腸道有益菌(雙歧桿菌和乳酸菌)的生長(zhǎng)也起到了類似的促進(jìn)作用。而且，青錢柳黃酮和三萜對(duì)于腸道中擬桿菌和擬桿菌等的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。有研究報(bào)道，藍(lán)莓多酚提取物能促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌在腸道內(nèi)的定殖，從而競(jìng)爭(zhēng)性的抑制病原菌在腸道內(nèi)的黏附和定殖[15]。

腸道細(xì)菌對(duì)于植物多酚在人體腸道內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化起到了重要作用[16]，因此植物多酚可能是腸道細(xì)菌發(fā)酵利用的合適底物。腸道細(xì)菌在腸道內(nèi)可以通過(guò)對(duì)于酚類化合物去糖基化從而釋放苷元，同時(shí)催化甲氧基脫甲基反應(yīng)。多酚的代謝產(chǎn)物可以到達(dá)結(jié)腸被腸道微生物利用，從而對(duì)腸道微生物的數(shù)量以及構(gòu)成產(chǎn)生影響[17]。腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡來(lái)發(fā)揮益生作用，同時(shí)雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌的增殖，可以有效抑制大腸內(nèi)氨、糞臭素以及胺類致癌物等的形成[18]。青錢柳黃酮和三萜發(fā)揮益生元功能，可能的機(jī)理是其作為抗氧化劑調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，從而為腸道中有益菌生長(zhǎng)和繁殖提供更有利的環(huán)境[19]。一般而言，腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌數(shù)量的增加可以更加有效的減少氨、糞臭素的形成，增加有機(jī)酸的產(chǎn)生，降低結(jié)腸及糞便的pH值，抑制病原菌的生長(zhǎng)。因此，青錢柳黃酮和三萜對(duì)腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)發(fā)揮了積極作用。

本實(shí)驗(yàn)以中國(guó)特產(chǎn)青錢柳為原料，制備得到了高純度的青錢柳黃酮和三萜。體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青錢柳黃酮和三萜對(duì)雙歧桿菌、乳酸菌都有較好的增殖作用，并對(duì)擬桿菌、梭狀菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。青錢柳黃酮和三萜只是改變了腸道內(nèi)菌體的組成，對(duì)總體菌群的數(shù)量基本沒(méi)有影響。在厭氧發(fā)酵24小時(shí)后，青錢柳黃酮對(duì)有益菌的增殖作用最強(qiáng)，同時(shí)相對(duì)于三萜顯著抑制了擬桿菌和梭狀菌的增殖。青錢柳黃酮及三萜類物質(zhì)在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，可能對(duì)于調(diào)節(jié)腸道的菌群平衡有著重要的作用，相關(guān)腸道代謝衍生物的方面，還需要進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明青錢柳黃酮和三萜可以通過(guò)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)于積極調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)，為甲基化兒茶素的作用機(jī)理研究及深入開(kāi)發(fā)利用奠定了良好基礎(chǔ)。